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期刊信息
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期刊名称:医药卫生
主管单位:科技部西南信息中心
主办单位:重庆维普资讯有限公司
出版单位:医药卫生杂志社

期刊总编:车东林

国内刊号:CN50-9219/R

国际刊号:ISSN1671-5675


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新闻详情

高速逆流色谱法分离甜叶菊中两种苷类成分的研究

发表时间:2024-04-21 21:10作者:​  何巧丽,马鹏,斌德艳,叶银梅来源:巴州人民医院

摘要:我们使用大孔吸附树脂的梯度洗脱技术对甜叶菊的乙醇回流提取物进行了梯度洗脱过程。甜叶菊中的苷类成分可以有效地分离出来。在这些溶剂中,最佳选择是正己烷、正丁醇和水的比例为1,5:5:5:5V/V/V的溶剂体系。该溶剂体系的分配系数和分离系数也符合我们的要求。为了分析分离产物的纯度,我们使用了高效液相色谱技术。采用面积归一化法。通过这种方法,成功地分离出甜叶菊中两种纯度超过90%的苷类化合物。这为我们进一步研究甜叶菊中的苷类成分和药效物质提供了重要的参考依据。

关键词:高速逆流色谱;甜菊糖:糖苷成分

中图分类号:R284.2    文献标识码:A


Separation of two glycosides from Stevia stevia by high speed countercurrent chromatography

HE Qiaoli, Ma Peng, Bin Deyan, Ye Yinmei(Corresponding author )

1Bazhou People's Hospital, Xinjiang Korla 841000


Abstract: The ethanol reflux gradient of stevia extract was achieved using a large pore absorption resin gradient technique.The glycosidic components in stevia can be effectively separated.The best choice among these solvents is a solvent system containing n-hexane, n-butanol, and water in a ratio of 1:5:5,5V/V/VThe distribution coefficient and separation coefficient of the solvent system also meet our requirements.In order to analyze the purity of the separated product, we use High-performance liquid chromatography.Using regional normalization methodsThrough this method, two stevia glycosides with a purity of over 90% were successfully isolated.This is an important reference material for our further research on stevia glycosides and pharmaceutical components.

Key words: high speed countercurrent chromatography; Stevia: glycoside component



甜叶菊属于菊科甜叶菊属多年生灌木。它是一种甜味剂草本植物,又名甜草、甜叶、甜草和蜜叶,原产于阿根廷、巴西和巴拉圭。甜叶菊叶比蔗糖甜,热量为零。甜菊醇是从这种植物中发现的一种二萜糖苷衍生物,比蔗糖更甜,用作甜味剂是安全的。有条件严格控制饮食的糖尿病患者和肥胖的高血糖患者可以使用甜菊糖苷作为替代甜味剂。除了具有降血糖作用外,甜菊糖甙还具有抗菌、消炎、降血压、杀菌、利尿、抗生育和强心的作用。有资料表明,甜叶菊对治疗皮炎、痤疮、湿疹等皮肤病也有很好的效果。甜叶菊叶含有丰富的植物成分,可作为儿童、成人和老年人的替代天然甜味剂,已被广泛食用1000多年[1]。甜菊叶富含甜菊糖甙,是一种天然甜味剂,其甜度高且热量低。甜菊糖苷是从甜叶菊植物的叶子和茎中提取得到的一系列混合物,包括甜菊糖苷、甜菊糖苷A、甜菊糖苷B、甜菊糖苷C等。其中,甜菊糖苷是二萜及其衍生物,是甜菊糖苷中最重要的成分。甜菊糖的主要成分是衍生物,其含量占甜菊糖的干重的6%至8%。甜菊糖是由甜菊糖甙(St)和甜菊双糖苷A(RA)组成的,它的甜味比蔗糖更强。甜菊糖的甜度是甘蔗糖的200-350倍,热量仅为甘蔗糖的1/300[2]。甜菊糖的甜味更纯净,是蔗糖的理想替代品[3]。

国际糖尿病会议确定了一种理想的调味剂-甜菊糖苷,它被视为糖尿病和高血压患者的最佳选择。它在国际上被称为"第三糖源",被认为是最有发展前途的"新糖源",也是最好的"天然甜味剂"[4-5]。甜菊提取物是一种具有抗菌、抗氧化、降血脂、降血糖、抗龋齿、抗肿瘤和利尿等多种功效的安全无毒物质,除了作为甜味剂的价值外,甜菊糖及其糖苷还对多种疾病具有治疗作用,如癌症、糖尿病、高血压、炎症、囊性纤维化、肥胖和蛀牙。研究表明,甜菊糖中的甜菊醇苷不会致畸、致突变或致癌,也不会引起急性和亚急性中毒。目前已被广泛应用于医药、食品、饮料、保健品、化妆品、畜牧、水产养殖、日用化工等相关领域,具有非常广阔的市场前景。国内的研究关于甜菊糖苷的提取纯化工艺、组分分离纯化和风味品质改善起步较晚,目前分离方法主要包括毛细管电泳、高效液相色谱、薄层色谱、结晶和树脂分离等几种技术[6-8]。毛细管电泳、高效液相色谱和薄层色谱法在敏感度、速度和操作简便性方面表现出色,但无法实现连续生产和大规模操作,并且通量极其有限,难以用于工业化生产,而且由于国内甜菊醇糖苷产品的质量参差不齐,大部分只是被用于初级加工之后出口到国外,无法取得较高的经济利益。很多甜菊醇糖苷品质不合格,导致生产企业无法出口产品赚取外汇。因此,甜菊醇糖苷的精制在中国的前景不容乐观。

高速逆流色谱(HSCC)是日本国立卫生研究院伊藤教授在1980年代初开发的一种分离技术[9]。是一种高效连续液相色谱技术。。HSCCC技术可应用于黄酮类、生物碱类、多酚类、蒽醌衍生物等多种天然产物的分离纯化,通过该技术分离的成分具有高度生物活性。HSCCC技术在快速分离目标产物的同时,能够获得高纯度和强生物活性的分离产物。近年来,它被广泛用于天然药物的定量分析、质量控制和高通量筛选。

本研究采用高效液相色谱结合高速逆流色谱(HSCCC)技术,利用其检测正己烷、正丁醇和水溶剂体系的分配系数(k)和分离因子(a),确定甜叶菊苷类成分的分离溶剂体系为正己烷:正丁醇:水(1,5:5:5: v/v/v)。这一发现为研究甜叶菊中两种苷类成分和有效成分的质量控制,以及为糖苷类化合物组成(包括甜叶菊)进行系统研究提供了一种可行的分离分析方法。

1.实验部分

1.1仪器和试剂

采用上海同坦生物科技有限公司生产的TBE-300A高速逆流色谱仪,配置TBP-50A泵,TBD-23UV紫外线探测器(波长210nm)和N2000双色谱站色谱仪采用3个分离柱,每个直径1.8mm,分离体积280ml,填充材料粒径0.6-0.8mm。用聚四氟乙烯管串联包装取20毫升样品。安捷伦-1220-LC-HPLC由美国安捷伦公司生产,配备DAD探测器和二进制泵。安捷伦Zorbax-SB-C18柱形色谱仪,柱径4.6mm× 250mm,包装材料长度5m。

所用化学试剂包括醋酸乙酯、甲醇、无水乙醇、95%乙醇、石油醚、水、色谱用甲醇、色谱用乙腈以及冰乙酸。这些化学试剂分别来自于天津科密欧化学试剂有限公司、盘锦天源药业有限公司、北京化工股份有限公司、天津富宇精细化工有限公司和天津市凯信化学工业有限公司。曲阜香洲甜菊制品有限公司生产的批号为MUST-14102111的甜菊醇苷对照品,高纯度莱鲍迪苷A对照品批号为20150203,纯度为98%,莱鲍迪苷A含量为40%的替代品也是由曲阜香洲甜菊制品有限公司生产。甜叶菊是由新疆阜康市采集的干燥叶片,经过新疆医科大学中医学院徐海燕副教授鉴定确认。

1.2试验方法

1.2.1用大孔吸附树脂法制备甜叶菊粗提取物

甜菊经过研磨机研磨成粉末后,经过筛网过滤,最终获得了2公斤的甜菊粉末。采用正交试验的优化提取工艺,通过精确称取100克甜菊药材粉末,并用2000毫升浓度为70%的乙醇进行连续回流提取,每次提取时间为一小时,并连续提取2次。随后将所得的提取液合并,并在浓缩到500mL后进行静置冷藏,待备用。

色谱柱中装有经过预处理的湿法AB-8多孔树脂,树脂的装载量为800 mL,柱的直径和高度比为1:12。首先,将树脂用乙醇洗脱,直到洗脱液中不再出现白色浑浊物。然后,使用蒸馏水将乙醇从树脂中洗掉,直到无醇味。确保洗涤液的液面高于树脂横截面。最后,将处理好的树脂备用。

將500 mL經上述處理的甜葉菊藥材濃縮液加入處理過的樹脂柱中靜置一晚,經充分吸附12小時後,分別加入30%、50%、70%和100%的乙醇,在使用梯度洗脫法分段收集洗脫液後,對所收集的洗脫液進行高效液相色譜分析,結果顯示70%乙醇洗脫液中St和RA的含量較高。将含有70%乙醇的洗脱液收集到一起,这些洗脱液会合并成为用于分离甜叶菊粗提物的洗脱液。然后,通过旋转蒸发将洗脱液浓缩成浸膏,将该浸膏放置在60℃的烘箱中进行干燥,直到浸膏的质量保持恒定。最终,得到大约500mg待分离纯化的甜叶菊粗提物。

1.2.2分配系数的测定

试验的目标是利用高效液相色谱法来探究不同溶剂体系中样品的分配系数。首先,于10 ml玻璃试管中精确称取约5 mg甜叶菊提取物及其替代物(包括St和RA)。将10mL已处于平衡状态的双相溶剂体系的上相和下相加入已称取粗提物的试管中。经超声振荡30分钟,以确保其与两相溶剂均匀混合。在两相溶剂与粗提物溶解完全达到平衡后,用移液枪等量移取上下相各500 µL,最后进行水浴中干燥。当化合物完全溶解在流动相中,通过高效液相色谱法(HPLC),测定在等体积流动相中的峰面积比,上相的峰面积测定为A1,下相中的峰面积测定为A2,K=A1/A2。

同时,我们也可以计算出分离因子a。分离因子a代表了两种物质分配系数的比例关系。

1.2.3分层时间测定

首先,在测定分层时间时,需将两种溶剂按照一定比例加入至干燥的分液漏斗中,并通过充分振摇一段时间来保证彻底混合。等待1个小时,使上层物质和下层物质在室温下达到平衡,然后将它们分离。将上层相和下层相各取出5 mL,然后将它们放入同一个具塞试管内。快速翻转试管数次,使两相充分均匀混合。接下来,立即将试管垂直放置,并启动秒表来测量两相完全分层所需的时间T。

1.2.4溶剂系统和样品溶液制备

本实验筛选了溶剂体系后,最终发现验证后使用的溶剂比例为正己烷:正丁醇:水为1.5:5:5(V/V/V)。在室温条件下,将经过验证比例的溶剂抽取到容量为500 mL的分液漏斗中,以便充分混合均匀,然后静置过夜。将平衡后的两种溶剂混合置于棕色广口瓶中,根据上下液相分离的标准,进行30分钟的脱气处理。使用甜叶菊提取物和经过粗提的甜叶菊替代物进行实验。将200毫克的甜叶菊粗提物和其相应的粗提物替代品分别溶解在10毫升的上下相中,保证称量的准确性。在4000 r/min下离心10分钟获得10mg/mL样品溶液,并对其进行超声完全溶解后用于HSCCC进样。

1.2.5HSCCC分离纯化工艺

调节恒温浴锅并将温度调节至30°C,将超声脱气相(恒相)泵入HSCCC螺纹管。的速度将螺旋管以30mL/min的速度用上相注满,使得固定相从出口端排出,然后缓慢向右旋转,调整主机的转速至900 r/min。同时将下相(流动相)以3mL/min的速度泵入螺旋管。达到平衡后,使用进样阀将容量为20 mL的粗提物溶液注入螺旋管中,同时打开色谱工作站,开始进行数据收集。使用230 nm波长的紫外检测器来检测液体的流出,并根据色谱峰将不同组分分别收集。

1.2.6HPLC分析

使用安捷伦Zorbax-SB-C18(4.6mm)色谱柱× 250mm,5m),安捷伦-1220-LC HPLC,使用乙腈磷酸钠缓冲液(pH=2.60)(32:68)作为流速相1mL/min,样本量10μL,样品分析时间10min,柱温40℃,检测波长210nm,所有样品在进入样品前通过0.45m的微孔滤膜过滤。

2.结果和讨论

2.1色谱条件的确定

通过对待分析样品在两相溶剂体系中的分配系数进行研究,可以为待测品的HSCCC分离选择合适的固定相和流动相。为了确保各个峰的良好分离,我们对高效液相色谱分离条件进行了优化。通过研究流动相组成、洗脱速度、柱温对分离过程的影响,最终找到了了最佳的色谱条件。

表1等度洗脱流动相的比例


序号
流动相比例
1
流动相:水:甲醇=32:68
2
流动相:水:甲醇=25:75
3
流动相:0.5%磷酸水:甲醇=25:75
4
流动相:0.5%磷酸水:甲醇=20:80
5
流动相:0.5%磷酸水:甲醇=32:68
6
流动相:水:乙腈=22:78
7
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=67:33
8
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=70:30
9
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=75:25
10
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=69:31
11
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=68:32
12
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=71:29
13
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=72:28
14
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=73:27
15
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=74:26
16
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=76:24
17
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=77:23
18
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=78:22
19
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=79:21
20
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=80:20
21
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=66:34
22
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=65:35
23
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=64:36
24
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=63:37
25
流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=62:38



流动相选择比较11.:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈=68:32

符合药典标准的要求,流动相的分离度和理论塔板数都达到要求。

安捷伦·Zorbax·SB-C18柱色谱仪(4.6mm)× 250mm,5m),流动相:磷酸钠缓冲盐(ph=2.60):乙腈(68:32),流速1mL/min,柱温40℃,检测波长210nm。在这种色谱条件下,除了St和RA峰之外,其他药材中的色谱峰不会对它们造成干扰。 色谱的基础相当流畅,顶端形状相当尖锐。理论上塔板数量大于2000,分离系数为1.52。以下是色谱图:

图1   St和RA的液体色谱(A:RA,B:St)

2.2 HSCCC分离条件的优化

溶液的成分在高速逆流色谱中对分离效果起着至关重要的作用[10]。不同溶剂的粘度、极性和密度可改变相同组分的溶解度和分配能力,从而导致不同的分配系数。我们的研究以甜叶菊糖苷的理化性质和相关文献为基础,从正己烷-乙酸乙酯-甲醇(乙醇)-水、氯仿-甲醇-水和氯仿-甲醇-正丁醇-水这几种中等极性[11]的溶剂体系中选择了合适的溶剂体系。最终,通过综合考虑不同的体系,我们在试验中选择了三个体系,分别是乙酸乙酯-正丁醇-水、氯仿-正丁醇-水和正己烷-正丁醇-水。





表2 甜叶菊粗提物中两种化合物在不同比例的溶剂体系中的分配系数


溶剂系统(v/v)
St、RA的分配系数(K)


St(K1)
RA(K2)
乙酸乙酯:正丁醇:水(3:2:5)
1.030
0.484
乙酸乙酯:正丁醇:水(1:4:5)
2.48
1.721
氯仿:正丁醇:水(1.5:3.5:5)
1.753
1.214
氯仿:正丁醇:水(1:4:5)
1.086
0.554
正己烷:正丁醇:水(1:4:5)
2.61
1.28
正己烷:正丁醇:水(1.2:3.8:5)
1.695
0.786
正己烷:正丁醇:水(1.5:3.5:5)
1.311
0.564
正己烷:正丁醇:水(1.5:5:5)
1.526
0.632
正己烷:正丁醇:水(3:2:5)
1.007
0.911
正己烷:正丁醇:水(0.5:4.5:5)
1.044
1.042
正己烷:正丁醇:水(2:3:5)
0.869
0.863
正己烷:正丁醇:水(2.5:2.5:5)
0.795
0.792
正己烷:正丁醇:水(3.5:1.5:5)
1.705
1.727
正己烷:正丁醇:水(4:1:5)
0.806
0.908



表3   甜叶菊粗提物中两种化合物在不同比例的溶剂体系中的分离因子



溶剂系统(v/v)
St、RA的分离因子(a)
乙酸乙酯:正丁醇:水(3:2:5)
2.128
乙酸乙酯:正丁醇:水(1:4:5)
1.441
氯仿:正丁醇:水(1.5:3.5:5)
1.444
氯仿:正丁醇:水(1:4:5)
1.960
正己烷:正丁醇:水(1:4:5)
2.039
正己烷:正丁醇:水(1.2:3.8:5)
2.156
正己烷:正丁醇:水(1.5:3.5:5)
2.324
正己烷:正丁醇:水(1.5:5:5)
2.414
正己烷:正丁醇:水(3:2:5)
1.105
正己烷:正丁醇:水(0.5:4.5:5)
1.002
正己烷:正丁醇:水(2:3:5)
1.007
正己烷:正丁醇:水(2.5:2.5:5)
1.004
正己烷:正丁醇:水(3.5:1.5:5)
0.987
正己烷:正丁醇:水(4:1:5)
0.888


注:1)分离系数a=K1/K2;2)K1、K2分别是表3中St、RA化合物的分布系数。

找到合适的溶剂体系有两个限制条件:一是确保溶剂体系中的化合物数量符合要求,二是满足所需的分配系数。理想的分配系数应当具有适当的数值,并且相邻的分配系数之间应当有适宜的差异。目标化合物在固定相中的溶解度增大则会导致分配系数过大,流动相将难以有效地将其洗脱出来。因此,如果分离时间延长,就有可能会导致固定相对化合物的截留增加,最终使化合物无法有效地被提取和分离出来。反之,若分配系数较小,则表示固定相在流动相中的溶解度较低,逆流色谱分离过程中目标化合物会随流动相迅速洗脱,导致出峰时间较短,无法实现充分的分离。物质的分配系数在0.2~5[12]之间被认为是易于分离的,所以组分的分配系数值必须有足够的差别。为了确保两个组分能够从基线上进行有效分离,最佳的分配系数应该大于1.5[13]。高极性化合物通常使用正丁醇和水的混合体系进行分离[14],但是当目标化合物的极性超出了正丁醇-水体系的范围,即使仍然使用该体系也难以获得满意的分离效果[15]。

在表3和表4中,一些体系的分离系数小于1,这些体系分别为正己烷:正丁醇:水(2:3:5)、正己烷:正丁醇:水(2.5:2.5:5)、正己烷:正丁醇:水(3.5:1.5:5)、正己烷:正丁醇:水(4:1:5)。从这些体系中我们可以看出,分配系数小于1的体系没有被考虑在内,因为HSCCC要求分配系数大于1.5才被认为是最佳的。在逆流实验中,使用了乙酸乙酯、正丁醇和水按照3:2:5的比例体系。然而,实验结果只有基线,分离效果非常差。可能的原因是,在进行紫外检测时,该体系具有强烈的紫外吸收,对样品检测造成了干扰。乙酸乙酯、正丁醇和水按照1:4:5的比例进行逆流实验时,观察到的峰很弱,几乎不可见,与乙酸乙酯、正丁醇和水按照3:2:5的比例分离效果稍好,但依然不太理想。逆流实验中发现,对氯仿、正丁醇和水按比例1.5:3.5:5组成的体系得到的峰行不理想。分离过程中,因为某些组分之间可能会有部分重叠,导致实验效果不如预期。通过对前一系统的稍加修正,我们对正己烷、正丁醇和水(1.5:5:5)的逆流实验进行了测试。实验结果显示,我们获得了两个较完整且清晰的峰形,这表明分离效果比较好。基于本次试验结果,我们确定了甜叶菊苷类成分分离的最佳溶剂体系是正己烷、正丁醇和水(1.5:5:5,v/v/v)。

2.3分离纯化结果HSCCC

使用正己烷:正丁醇:水(1.5:5:5,v:v:v)作为甜菊糖粗提取物及其替代品的分离溶剂系统,测得固定相保留率为58.5%,分离时间为120 min。HSCCC色谱图为表5、表6。



图2   甜叶菊St及RA替代品高速逆流色谱图 


图3   甜叶菊提取物制备型高速逆流色谱图

图4   未经分离样品HPLC图谱(1:RA.2:St)

图5   经HSCCC分离后样品中St的HPLC图谱 


图6   经HSCCC分离后样品中RA的HPLC图谱 


3 结论

我们利用大孔吸附树脂和HPLC技术来开展研究,并成功地建立了分离甜叶菊中两种苷类成分的HSCCC方法。建立该方法对于甜叶菊中苷类成分的鉴定和分离,并对以糖苷类为标准的中药材的质量控制起到了重要作用。此外,该方法为选取中药和天然产物的溶解系统以及溶剂比例等方面提供了有用的参考。HSCCC具有分离结果纯净、制备量较大、重现性好、操作简便等优点,因此适用于制备高纯度的活性物质对照品。


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作者简介:何巧丽,1990,女,主管药师,主要从事药品调剂工作

*通讯作者:叶银梅,女,主任药师,主要从事临床药学管理工作。


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