基于石墨烯量子点的荧光猝灭法测定芦丁含量

摘要：目的 利用柠檬酸热解法制备石墨烯量子点，考察芦丁对其荧光猝灭情况，并在此基础上建立芦丁的含量测定方法。方法 采用柠檬酸热解法制备石墨烯量子点，并用紫外分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法进行结构表征及荧光特性的考察。结果 制备的石墨烯量子点在468nm处有强荧光，而芦丁的加入，可使其荧光发生猝灭现象。分别考察了不同pH的醋酸盐缓冲溶液，不同的反应时间，量子点浓度，反应温度及试剂加入顺序等因素对荧光猝灭的影响。在最佳实验条件下，建立了以石墨烯量子点为探针测定芦丁的新方法。在此实验条件下，芦丁浓度在2.38 × 10－5 ～1.67× 10 -4mol /L范围内与荧光猝灭值ΔF呈良好的线性关系，线性方程为ΔF=1.4731C（μmol/L）-51.362，R2=0.9991。方法检出限为0.0244μmol/L，相对标准偏差为1.8%。结论 通过柠檬酸热解法制备的石墨烯量子点具有良好的荧光特性，利用石墨烯量子点作为荧光探针建立了测定芦丁的新方法。将该法应用于片剂中芦丁的含量测定，结果满意。

关键词：石墨烯量子点；荧光猝灭；柠檬酸；芦丁

中图分类号：Q51

Determination of rutin by fluorescence quenching method based on graphene quantum dots

HUI Menglin   ZHAO Yucai   YUAN Congzheng   JIA Baoxiu(Corresponding author)

College of Pharmaceutical, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, Shandong Jinan 250117

Abstract: OBJECTVE To prepare graphene quantum dots by citric acid pyrolysis. The fluorescence quenching of rutin was investigated. On this basis, a method for the determination of rutin was established. METHODS Graphene quantum dots were prepared by citric acid pyrolysis. The structure and fluorescence properties of graphene quantum dots were characterized by ultraviolet spectrophotometry, infrared spectrophotometry and fluorescence spectrophotometry. RESULTS The results show that the graphene quantum dots have strong fluorescence at 468 nm, and the addition of rutin can quench the fluorescence. The effects of acetic acid buffer solution with different pH, reaction time, quantum dot concentration, reaction temperature and the order of reagent addition on fluorescence quenching were investigated. Under the optimum experimental conditions, a new method for the determination of rutin using graphene quantum dots as probe was established. Under the best experimental conditions, the concentration of ruitn in the range of 2.38 × 10－5 ～ 1.67× 10 -4mol /L has a good linear relationship. The linear equation is ΔF=1.4731C（μmol/L）-51.362, R 2=0.9991. The detection limit was 0.0244μmol/L and the relative standard deviation was 1.5%. CONCLUSION Graphene quantum dots prepared by citric acid pyrolysis have good fluorescence properties. A new method for the determination of rutin was established by using graphene quantum dots as fluorescence probes. The method has been applied to the determination of rutin in tablets with satisfactory results. 

Key words: graphene quantum dots; fluorescence quenching; citric acid; rutin

纳米生物技术是 21 世纪发展最快和跨领域度最广的一种纳米科学，无论是在科学研究还是在实际应用中都展现着重要的意义。新一类荧光碳基材料的石墨烯量子点(GQDs)具有出色的生物相容性[1]，独特的光学性质以及容易被修饰的材料表面和边缘[2]，近几年来取得广泛关注，被用于多种领域，如水质监测[3-4]，体液检测[5]，临床诊断，基因诊断，生物成像[6]，药物传输[7]等。

芦丁又称为芸香甙(Rutin)，是一种具有生物活性的多羟基黄酮类化合物，其主要作用有清除自由基抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗病毒、镇痛等，用于预防及治疗“三高”、脑血栓，对视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎等疾病也有疗效[8]，在临床上有着难以取代的作用。除用作药物外，研究者还基于芦丁的强身健体、抗老化作用，开发出“槐米茶”、“芦丁茶”等系列保健茶品。目前，芦丁的测定方法主要有
高效液相色谱法[9]、荧光光度法[10]、修饰电极法[11]、高效毛细管电泳法[12]。

本文采用自下而上法中的柠檬酸热解法制备GQDs，制备得到的GQDs在365nm紫外灯下发出蓝色荧光，利用其荧光特性，与芦丁反应产生荧光猝灭，建立一种基于GQDs的荧光猝灭检测芦丁的新方法。

1 仪器与试剂

Cary-Eclipse型荧光分光光度计；U-3900A型紫外分光光度计（日立）；FR224CN电子天平(奥豪斯仪器（上海）有限公司)；HJ-3恒温磁力搅拌器（江苏金坛市环宇科学仪器厂）；磁力加热搅拌电热套（北京市佳祥科利仪器有限公司）；HH-1恒温水浴锅(国华电器有限公司)；UPHW-优普系列超纯水机（成都超纯科技有限公司）；W6267-01 防水笔型 pH 计；大龙移液器（DRAGONMED，型号5-50μL）；M2967-04微量荧光比色皿。

芦丁（上海融禾医药科技有限公司；批号：140109；纯度：＞99％）；冰醋酸（北京高纯科技有限公司，含量≥99.5％）；乙酸钠（天津市博迪化工有限公司；含量≥99.0％）甲醇（天津市永大化学试剂有限公司；批号：20220223）；柠檬酸(天津市北方化玻购销中心，含量≥99.5％)；氢氧化钠（天津市大茂化学试剂厂，含量≥96.0％）；硝酸（莱阳市康德化工有限公司，批号：201708237）；芦丁片（天津力生制药股份有限公司，产品批号2109003）。除另有说明，所用试剂均为分析纯，实验用水均为UP超纯水。

2 实验方法

2.1 石墨烯量子点的制备

本文采用柠檬酸热解法制备GQDs[13]。具体方法如下：称取2.0g柠檬酸固体于50ml烧杯中，用加热套在110V条件下加热，此时为无色柠檬酸固体，当加热4min时，无色固体开始融化，加热8min左右完全融化，此时为无色溶液，加热12min左右，溶液变为浅黄色，当加热到19min时，此时溶液由浅黄色变为橘黄色，停止加热。在磁力搅拌的作用下，将橘黄色液体逐滴加入100ml的10mg/ml
的NaOH溶液中，继续搅拌15min。然后用稀硝酸（1：10）调节pH至中性，大约消耗10ml稀硝酸，得到的溶液即为GQDs，用微孔滤膜过滤后，将获得的工作液放置于4℃的冰箱保存备用。

2.2 荧光强度的测定

用移液枪吸取100μL的GQDs工作液置于微量荧光比色皿中，依次加入100μLHAc-NaAc缓冲溶液(pH=7.0)，加入不同体积的芦丁溶液，充分摇匀，在荧光分光光度计上测定激发波长为390 nm发射波长468nm下的荧光强度F和不加芦丁的荧光强度F0，狭缝宽度均为5nm。

3 实验结果与讨论

3.1 GQDs制备条件的优化

GQDs的荧光强度与热解柠檬酸时加热的温度关系密切，本文分别在50 V，110V，150 V，220 V的条件下加热柠檬酸得到的GQDs，扫描不同激发波长下荧光光谱图如图1所示。

比较四幅荧光光谱图，可以发现在110 V加热条件下，也就是200℃时得到GQDs的荧光强度最大，荧光性能最好。同时，不同激发波长对荧光峰的位置影响不大，但对荧光强度有一定的影响，50 V加热条件下，激发波长为400 nm时荧光强度最大；110 V加热条件下，激发波长等于390nm时发射峰的荧光强度最大；150 V加热条件下，激发波长为370nm时荧光强度最大；220 V加热条件下，激发波长为380 nm时荧光强度最大。而后续实验发现温度对GQDs的粒径影响不大，因此本文后续实验均用110 V制备的GQDs。

图1   50 V（a），110V（b），150V（c），220V（d）柠檬酸制GQDs的荧光光谱图

3.2 GQDs的表征

3.2.1 GQDs的粒径测定

热解柠檬酸制GQDs通过纳米粒度和电位仪测得GQDs粒子分布较为均匀，平均粒径为170.0 nm。与参考文献[13-14]中的GQDs的平均粒径（均为4nm）有较大差别，推测由于两篇文献中均使用透射电镜测量石墨烯量子点固体粉末，而本文选择了纳米粒度和电位仪测量GQDs液体的粒径，水合粒子的粒径显著大于GQDs固体粒子本身，所以本实验所测粒径偏大。

3.2.2 GQDs的荧光特性

将制成的GQDs分别在自然光和365 nm紫外灯下照射，获得的荧光照片如图2所示，从图中可以观察到直接裂解柠檬酸产生的GQDs发出明亮的蓝色荧光（468nm）。

图2   自然光（a）及紫外灯（c）照射下的GQDs

同时利用荧光分光光度计扫描其激发及发射光谱图（3a），由图可以看出GQDs的最大发射波长为468 nm，斯托克斯位移是78 nm。扫描不同激发波长下的荧光光谱图，从图3b 能够看出，发射峰的位置并不受激发波长的影响，而荧光强度则会受制于激发波长。把激发波长自350 nm升高至390 nm后，荧光发射光谱的强度有所增强；把激发波长自390 nm增加到410 nm后，荧光强度则会降低，于是判定最佳激发波长是390 nm。

图3   柠檬酸制GQDs的激发光谱和发射光谱图（a）和在不同激发波长下的荧光图（b）

3.3 芦丁对其荧光强度的影响

通过实验发现，芦丁的加入可以猝灭GQDs的荧光，使荧光信号“关闭”。从图4可以看出，在一定的浓度范围内，随着芦丁浓度的增加，GQDs 的荧光信号猝灭程度随之有规律地增加，由此拟建立一种基于GQDs的荧光猝灭检测芦丁的新方法。

图4   不同浓度的芦丁对GQDs的荧光猝灭情况

3.4 实验条件的优化

3.4.1 反应时间影响

本实验考察了芦丁对GQDs的荧光猝灭程度与反应时间的关系，GQDs与芦丁混合后，GQDs 荧光猝灭，猝灭信号值至少在2小时内可以保持稳定。不同反应时间对GQDs和芦丁体系的猝灭作用的影响如图6所示。由图可知，随着时间的推移，荧光强度稍有增大，但10min后几乎不再发生改变，所以反应时间选择在10min内。

图5   反应时间对荧光猝灭程度的影响

3.4.2 溶液pH对体系荧光强度的影响

考虑到体系的pH可能会对荧光强度造成一定的影响，本实验采用醋酸盐缓冲液作为反应介质。本实验探究了缓冲液的不同酸度对GQDs荧光特性的影响。由实验可知，使用 pH =7.00的缓冲体系时，荧光猝灭强度最大。考察了pH = 7. 00 的HAc-NaAc 缓冲溶液用量对体系的影响，当缓冲液用量为100μL时，芦丁对体系的荧光猝灭最强，因此本实验选取100 μL的pH＝7的 HAc-NaAc 来调节体系的pH值。

图6   pH对体系荧光强度的影响

3.4.3 GQDs的用量优化

在荧光比色皿中加入100μL HAc-NaAc缓冲液(pH=7.0)，100μL的芦丁，然后依次加入不同体积（浓度）的GQDs溶液，考察了GQDs 用量在50～450μL时对反应体系的影响，由图7可以看出，当 GQDs 用量为100μL时，ΔF达到最大值，因此实验选用100μL的GQDs。

图7   GQDs用量对体系荧光强度的影响

3.4.4 加入顺序对荧光强度的影响

本文探究了GQDs、缓冲液以及芦丁的不同加入顺序对GQDs荧光特性的影响，结果发现加入顺序的改变几乎不影响GQDs的荧光特性。所以本实验选择依次加入GQDs、缓冲液和芦丁溶液。

3.5 分析参数

在最佳实验条件下，根据实验方法2.2，芦丁溶液在2.38×10－5 ～1.67×10-4mol/L浓度范围内与ΔF呈良好的线性关系（图9，线性回归方程为ΔF=1.4731 C（μmol/L）-51.362，R2=0.9991。检测限为3σ（σ =S0 /S，S0为空白溶液多次测量的荧光强度的相对标准偏差，为1.2%，S为线性方程的斜率）为0.0244μmol/L。为了考察本实验的精密度，以加入55.6μmol/L的芦丁溶液的体系进行11次荧光强度的测定，其相对标准偏差为1.8%。

3.6干扰实验

在优化的实验条件下，固定芦丁溶液（55.6μmol/L）体积为100μL，以相对误差不超过±5%为限，1000倍的蔗糖、葡萄糖、硬脂酸镁、Ca2+、SO42-不干扰测定，500倍的Mg2+、Cl-不干扰测定，50倍的Cu2+不干扰测定。

3.7 样品及回收率测定

取10片芦丁片，用电子天平精密称取其总重量并且记录数值，然后研磨成粉末，准确称取0.0330g芦丁片粉末，放置于容量瓶中，加入甲醇摇匀，并定容到25mL的刻度线，然后50℃水浴提取5min，过滤除去残渣，得供试液。按照实验方法2.2测定其荧光强度，并代入上述线性方程中，计算出样品溶液浓度为111.26μmol/L，计算标示量的百分含量，得出结果为111.25%。

精密量取一定量的5.56×10-4mol/L的芦丁样品溶液，按照标准品含量：样品含量=0.8：1；1：1；1.2：1比例加入不同体积的对照品溶液（浓度为5.00×10-4mol/L）。通过前述方法得出总含量，根据公式加标回收率%=（加标量-未加量）/加标量×100%，计算出芦丁片的加标回收率在81.08%～109.52%，说明该方法就有良好的准确度，可以将其应用于实际样品中的芦丁含量的测定。具体结果见下表1。

表1   回收率的测定结果(n=3)

4 结论

本文采用热解柠檬酸制备了平均粒径为170.0nm的发明亮蓝色荧光的GQDs。通过荧光光谱法、粒径法、紫外光谱法对其性质进行表征，结果发现制备的GQDs具有较高的荧光强度、稳定的发光性能以及良好的水溶性。研究表明，芦丁的加入可以使GQDs的荧光发生不同程度的猝灭现象。基于此，探讨了体系的反应时间、GQDs用量以及pH值等对体系荧光强度的影响，建立了测定芦丁的高灵敏度、高选择性的新方法。用于实际样品中芦丁含量的测定，结果准确。

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基金项目：泰安市科技创新发展项目（政策引导类）（2021NS268）山东第一医科大学本科生研究计划暨大学生创新创业训练计划项目(2022104391683)。