新建人类辅助生殖实验室的质量检测

摘要：目的 通过第三方空气质量检测、鼠胚试验以及新旧实验室半年的临床数据对比，评估我院新建胚胎实验室环境及培养体系是否达到体外培养胚胎的质量控制要求。方法 （1）聘请第三方检测公司对我院新建实验室进行空气质量检测。（2）统计分析体内受精卵体外培养和完全体外受精培养两种试验方法获得的2-细胞胚胎的囊胚形成率。（3）回顾性分析新旧实验室半年的临床数据，评估新建实验室环境是否影响胚胎发育及妊娠结局。结果 （1）第三方检测公司检测结果显示我院新建实验室空气质量各项指标均达标。（2）体内受精试验总共获得389枚2-细胞胚胎，形成371枚囊胚，囊胚形成率95.37%；体外受精试验总共培养249枚2-细胞胚胎，形成227枚囊胚，囊胚形成率91.16%。（3）新旧实验室半年的D3可用胚胎率（86.97% vs 87.01%）、囊胚形成率（70.94% vs 71.88%）、临床妊娠率（62.98% vs 69.07%）及早期流产率（8.74% vs 6.67%）均无统计学差异（P＞0.05）。结论 我院新建胚胎实验室环境及培养系统稳定，可用于继续开展人类辅助生殖技术胚胎培养，空气质量检测结合鼠胚试验可以作为新建实验室的一种有效评估方法。

关键词：质量检测；鼠胚试验；囊胚；妊娠率

中图分类号：Q959

New laboratory for human assisted reproduction quality control

CHEN Meijuan   WANG Xuefang   SU Ketong（Corresponding author）

Jiuhe Hospital, Guangdong Zhanjiang 524057

Abstract: Objective: To evaluate whether the environment and culture system of our hospital's newly built embryo laboratory meets the quality control requirements of in vitro embryo culture through air quality detection by testing organization, mouse embryo assay and half-year clinical data comparison between the old and new laboratory.   Methods 1. The testing organization was hired to test the air quality in the newly built laboratory of our hospital. 2. Statistics were used to examine the blastocyst rate of 2-cell embryos created during in vitro culture and successful in vitro fertilization. 3. Clinical data from both the old and new laboratories were retrospectively compared over six months to determine whether the new laboratory's atmosphere affected embryo development and pregnancy outcome. Results 1. The detection institution's tests revealed that our hospital's brand-new laboratory met all required air quality indices. 2 In vivo fertilization, 389 2-cell embryos were obtained, formed 371 blastocysts, and the blastocyst rate was 95.37%. Through in vitro fertilization, 91.16 percent of 249 2-cell embryos
developed into 227 blastocysts. 3. The Day 3 available embryo rate (86.97% vs. 87.01%), blastocyst formation rate (70.94% vs. 71.88%), clinical pregnancy rate (62.98% vs. 69.07%) and early abortion rate (8.74% vs. 6.67%) in the new and old laboratories for six months had no statistical difference (P > 0.05). Conclusion. The environment and culture system of our hospital's new embryo laboratory are stable and can be used for embryo culture of human-assisted reproduction technology. The new facility could benefit from an evaluation strategy that combines air quality detection and the mouse embryo assay.

Keywords: Quality test, mouse embryo assay, blastocyst, pregnancy rate

人类辅助生殖技术(assisted reproductive technology , ART）在我国已呈规模化发展，通过辅助生殖技术出生的婴儿占比越来越高。IVF实验室作为胚胎体外发育的重要场所，其环境以及各种仪器设备的稳定性都直接影响ART治疗结局[1]。Poletto等[2]研究表明，实验室的空气质量直接影响胚胎的质量以及后续的妊娠率、流产率等。Morbeck等[3]也表明了降低实验室空气中的挥发性有机物（VOC）有助于改善临床结局。然而，新建成的IVF实验室中装修材料和新仪器设备的挥发性有机物（VOC）、尘埃粒子等都是降低实验室空气质量的重要因素。因此，对新建成的IVF实验室进行全方位的检测是必不可少的环节。目前，实验室环境质量检测方法有很多种，包括空气质量检测、生物学检测等，而应用最广泛的生物学检测方法是小鼠胚胎试验（mouse embryo assay , MEA）[4-5]。MEA又分为体内受精和体外受精两种试验方法。本中心在新IVF实验室建成后聘请第三方检测公司进行空气质量检测，随后进行了体内和体外鼠胚试验，结合新旧实验室半年的胚胎发育和妊娠结局数据，综合评估我院新建IVF实验室环境以及培养体系是否达到体外培养胚胎的质控标准，为后续继续开展辅助生殖胚胎培养提供依据。

1 材料与方法

1.1 空气质量检测

聘请第三方检测公司对我院新建胚胎实验室进行空气质量检测。

1.2 鼠胚试验

1.2.1 试验动物

昆明小白鼠，购自南方医科大学实验动物管理中心，雌鼠选用6-8周龄，公鼠10-12周龄，适应性饲养一个星期开始试验。

1.2.2 药品及试剂

孕马血清（PMSG）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）均购自南京爱贝生物科技有限公司，洗精受精液G-IVF、卵裂培养液G1、囊胚培养液G2、石蜡油均购自VitroLife公司。

1.2.3 耗材及仪器

培养皿、离心管、移液管均购自美国Corning公司，三气培养箱购自美国COOK公司（ K-MINC-1000），体视显微镜购自日本Nikon公司（SMZ-1000），倒置显微镜购自日本Olympus公司（IX73），超净工作站购自日本Astec公司（AT-130）。

1.2.4 试验方法

①小鼠超数排卵

第1天下午5点母鼠腹腔内注射PMSG 10 IU／只，48h后腹腔内注射HCG 10 IU／只。

②体内受精试验

母鼠注射HCG后与公鼠1：1合笼，次日早晨查阴道栓，下午解剖阴道栓阳性母鼠取受精卵，将出现原核的受精卵挑选出来，用G1清洗两遍后放入平衡好的G1皿中，然后放入三气培养箱中培养。

③体外受精试验

（1）精子的采集与获能：取卵前先取精，解剖公鼠，把附睾分离出来，用G-IVF清洗两遍，然后用注射器针头将附睾体撕碎，让精子游离出来。80%的精子梯度液300g离心20min，洗精5min，弃上清，加入新的G-IVF后放入三气培养箱中上游30min。

（2）卵母细胞的收集：母鼠注射HCG 14-16h后解剖，将输卵管取出，用注射器将输卵管壶腹部撕破使卵子溢出，将卵子收集到平衡好的G-MOPS中清洗，然后转入G-IVF中清洗2遍后转到G-IVF滴中培养。

（3）授精：精子上游获能后按浓度5×106/ml将精子加到卵子滴中，6-8h后从精滴中转出卵子，将出现原核的受精卵挑选出来，G1清洗两遍后转到平衡好的G1皿中培养。

④ 胚胎的培养与观察

第1天、第2天、第3天分别观察2细胞、4细胞、8细胞期，到8细胞时将胚胎转至囊胚培养皿中继续培养。第5天观察囊胚形成情况并记录，第6天观察囊胚孵出情况（图1）。

A：2-细胞胚胎；B：4-细胞胚胎；C：8-细胞胚胎

D：桑葚胚； E：囊胚； F：孵化囊胚

图1   体外培养的小鼠胚胎

1.3 新旧实验室数据比较

回顾性分析旧实验室半年以及新医院半年的D3可利用胚胎率、囊胚形成率、HCG阳性率、临床妊娠率和早期流产率，统计分析新建实验室的胚胎培养质量与妊娠结局是否受环境影响。

1.4 数据分析

采用SPSS 21进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.5 试验结果

第三方检测公司对我院新建实验室各个培养室的空气质量检测报告显示各项指标均达到标准要求。

2 鼠胚试验

2.1 体内受精试验结果 

总共做了5个批次试验，解剖阴道栓阳性雌鼠20只，共获得393枚2PN胚胎，389枚2-细胞胚胎，形成371枚囊胚，卵裂率98.98%，囊胚形成率95.37%（表1）。

表1   昆明小白鼠体内受精胚胎培养试验结果

2.2 体外受精试验结果

总共做了4个批次试验，解剖雌鼠14只，共获得249枚2PN胚胎，249枚2-细胞胚胎，形成227枚囊胚，卵裂率100%，囊胚形成率91.16%（表2）。

表2   昆明小白鼠体外受精胚胎培养试验结果

2.3 不同组别小鼠胚胎发育情况比较

体外受精组和体内受精组小鼠在卵裂率、2-细胞囊胚形成率上差异均无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3   不同组别小鼠胚胎发育数据比较

3 新旧实验室数据比较

3.1 新旧实验室胚胎发育情况比较

统计旧实验室以及新实验室半年的常规IVF周期标准人群的2PN率、卵裂率、D3可利用胚胎率以及囊胚形成率差异均无统计学意义（P＞0.05）（表4）（标准人群：年龄≦40岁，获卵﹥5枚）。

表4   常规IVF周期标准人群新旧实验室受精及胚胎发育情况比较

3.2 新旧实验室妊娠结局比较

统计旧实验室以及新实验室半年的常规IVF新鲜移植周期标准人群的HCG阳性率、临床妊娠率以及早期流产率，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表5），平均移胚数新实验室较旧实验室少，差异有统计学意义（P＜0.05）（标准人群：年龄≦40岁，获卵﹥5枚）。

表5   常规IVF新鲜移植周期标准人群新旧实验室妊娠结局比较

4 讨论

IVF实验室是实施人类辅助生殖技术最重要的场所，其环境以及培养系统的稳定对临床结局有着重要的影响。在自然妊娠过程中，配子和胚胎是在受到了母体的保护，但体外培养的胚胎自身不具备任何屏障和保护功能，环境中的有害物质、培养系统不稳定等都有可能降低胚胎的发育潜能[6]。而新建成的IVF实验室中装修材料和新仪器设备的挥发性有机物（VOC）、尘埃粒子等都是降低实验室空气质量的重要因素。本中心在新实验室建成后聘请第三方检测公司进行空气质量检测，结果显示空气质量合格。

影响体外培养胚胎质量的因素包括实验室的温度、湿度、空气的质量、培养箱及操作工作台等设备的正常运行以及实验人员的操作水平等。为了维持较好的体外培养胚胎质量以及临床妊娠率，需要一个可靠的质控系统对培养系统以及人员操作水平的稳定性进行质量控制[7]。小鼠早期胚胎跟人早期胚胎发育过程相似，可以很好地模拟人胚胎体外培养的全过程，因此，鼠胚试验常用于新建IVF实验室的质量控制。

我们的鼠胚试验结果显示，体内受精试验共获得393枚2PN胚胎，分裂成389枚2-细胞胚胎，形成371枚囊胚，卵裂率98.98%，囊胚形成率95.37%；体外受精试验共获得249枚2PN胚胎，全部卵裂成2-细胞胚胎，形成227枚囊胚，卵裂率100%，囊胚形成率91.16%。两组试验结果无统计学差异，囊胚形成率均大于80%，达到国家人类体外辅助生殖技术医疗器械-鼠胚实验质控标准。而本研究中体内受精试验囊胚形成率高于体外受精试验组，这跟国内已有报导的结果一致[8-10]，这可能与体外受精组卵子在体外培养的时间较长、精子是未经自然选择的附睾精子以及人员操作等因素有关。

体外受精和体内受精鼠胚试验均适用于新建IVF实验室的质量控制。邵明清等[10]研究表明，体内受精试验更适用于新建IVF实验室的质控管理。因为体外受精的受精率、卵裂率等与操作人员的操作水平相关，而体内受精试验可以减少人为因素的干扰，能更准确地反映培养环境及培养系统的问题。而本研究通过体内受精和体外受精两种试验方法，对本中心新建IVF实验室、培养箱培养液等培养体系以及操作人员做了全面的质控，结果显示各项指标均达到了质控标准。

此外，我们还回顾性分析了新旧实验室半年的胚胎发育数据以及妊娠结局。结果显示新旧实验室卵裂率、D3可用胚胎率、囊胚形成率、HCG阳性率、临床妊娠率以及早期流产率等均无统计学差异。

综上所述，我院新建胚胎实验室环境以及培养体系稳定可靠，可用于开展人类辅助生殖体外受精-胚胎移植技术，第三方空气质量检测结合鼠胚试验可以作为新建实验室的一种有效评估方法。

参考文献

[1]黄国宁,刘东云,韩伟.辅助生殖技术实验室的建设及其质量控制[J].中国实用妇科与产科杂志,2010,26(10):755-758.

[2]Poletto, K.Q., Y.A.R. de Lima, and M.S. Approbato, Effect of the Air Filtration System Replacement on Embryo Quality in the Assisted Reproduction Laboratory[J]. Rev Bras Ginecol Obstet,2018,40(10):625-630.

[3]Morbeck, D.E., Air quality in the assisted reproduction laboratory: a mini-review[J]. J Assist Reprod Genet,2015,32(7):1019-1024.

[4]Navid E., Ashley G., Mouse embryo assay for human in vitro fertilization quality control : a fresh look[J].Journal of Assisted Reproduction and Genetics,2020,37:1123-1127.

[5]Lierman, S., et al., Double-quality control reveals high-level toxicity in gloves used for operator protection in assisted reproductive technology[J].Fertil Steril,2007,88(4 Suppl):1266-1272.

[6]黄国宁,孙海翔.体外受精-胚胎移植实验室技术[M].北京:人民卫生出版社,2012.

[7]杜湧瑞,张云山.质量管理系统在体外受精实验室中的应用[J].国际生殖健康计划生育杂志,2013(2013):498-501.

[8]王辉田,李涛,黎伟豪,等.鼠胚实验在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用[J].实用妇产科杂志,2015,31(2):115-119.

[9]屈春凤,莫凤明,蒋军松,等.利用鼠胚实验对新建人类辅助生殖实验室进行质量控制分析[J].生殖医学杂志,2018(25):482-485.

[10]邵明清,邵南齐,李晓芳.两种鼠胚试验方法的比较[J].黑龙江畜牧兽医杂志,2017(04):238-240.