基于网络药理学探讨氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的作用机制

摘要：目的 基于网络药理学探讨氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的作用机制。方法 采用pubchem、pharmmapper预测氯沙坦的作用靶点,使用“GeneCards”、“DisGeNET”和“OMIM”数据库搜索自身免疫性心肌炎的疾病靶点。将药物作用靶点和疾病靶点取交集后得到潜在治疗靶点。利用Cytocape3.8.2软件构建“药物-靶点-疾病”的网络图,并使用STRING平台构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI)。再对潜在治疗靶点进行GO和KEGG富集分析,寻求基因的共同的功能及相关通路。结果 对多数据库获得的靶点基因和药物靶点分别取并集,得到147个药物靶点和1038个疾病靶点。氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的交集靶点39个,从其中筛选出 PPI 核心靶点为MMP9、CASP3、MMP2、ACE、REN、PPARG、MAPK14、IL2、HMOX1、MMP3。潜在治疗靶点基因集中于IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、T细胞受体信号通路、TNF信号通路、松弛素信号通路等信号通路。结论 研究表明,氯沙坦是通过多靶点和多通路的调控方式来治疗自身免疫性心肌炎,为未来使用氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎提供了理论参考。

关键词：氯沙坦；自身免疫性心肌炎；生物信息学；网络药理学；作用机制

中图分类号：R542.2+1

0 引言

心肌炎是一种炎症性和氧化性疾病，其特征是受损组织和器官功能障碍中的免疫细胞聚集[1]。自身免疫性心肌炎的发生与多种因素有关,如全身/局部原发性自身免疫、病毒感染、HLA和性别偏见、隐性抗原暴露、拟态、胸腺训练不足/Treg诱导等[2]。研究表明,免疫调节剂及免疫抑制剂、抗生素、中草药、心血管疾病治疗药物等实验性药物能够治疗自身免疫性心肌炎。这些药物能显著减轻自身免疫性心肌炎引起的炎症和纤维化,减轻自身免疫性心肌炎引起的显性淋巴细胞增殖,同时降低Th1细胞因子(IFN-γ和IL-2)，增加Th2细胞因子(IL-4和IL-10)[3]。比如,杨梅素可以抑制心肌的自身免疫反应及MCP-1在心肌细胞中的表达,调节免疫反应及MCP-1的表达从而改善自身免疫心肌炎[4]。炙甘草汤在实验性自身免疫性心肌炎发展中能够减轻炎症反应，通过减少活化的炎症细胞及抑制心肌中的炎症细胞因子分泌来对抗实验性自身免疫性心肌炎，从而起到改善心肌炎症反应、降低心肌损伤的作用[5]。SGLT-2抑制剂卡格列净可改善实验性自身免疫性心肌炎患者的心脏炎症[6]。同时,苦参生物碱和西洋参总皂苷联合用药可通过NF-κB和TGF-β1通路减轻实验性自身免疫性心肌炎的纤维化进程[7]。

氯沙坦是一种血管紧张素II (Ang II)受体阻滞剂,作用于Ang II型1型受体(AT1R)亚型,是一种治疗高血压的处方药[8]。目前研究表明，氯沙坦可以减轻疾病的炎症,同时也具有延缓纤维化进程的作用。氯沙坦通过tlr4介导的NF-κB和MAPK信号通路调节巨噬细胞的极化,从而减轻脓毒症诱导的心肌病[9]。氯沙坦还可通过泛素化作用调控TGF-β/Smad及其代谢途径,降低肾间质纤维化[10]。

氯沙坦能否具有降低自身免疫性心肌炎的炎症及纤维化作用未知,因此研究氯沙坦如何对自身免疫性心肌炎发挥治疗作用具有重要意义。本研究旨从网络药理学角度探究氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的潜在作用机制，分析氯沙坦可能的基因靶点和通路，为后续的氯沙坦临床应用和氯沙坦的药理作用研究提供理论依据。

1 方法

1.1 氯沙坦潜在的靶点筛选

在pubchem数据库检索“Losartan”,获得氯沙坦的SDF结构式。在pharmmapper (http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/)数据库上传SDF结构式,然后进行氯沙坦的靶点预测，在预测结果中选择“zscore＞0”的靶点,作为氯沙坦的潜在靶点。

1.2 自身免疫性心肌炎的潜在靶点筛选

以“autoimmune myocarditis”作为关键词在“GeneCards”、“DisGeNET”和“OMIM”数据库中检索,获得自身免疫性心肌炎的潜在靶点。其中在“GeneCards”数据库检索的潜在靶点中,以“Relevance score≥中位数”的标准进行筛选,然后将结果与其他两个数据库的结果进行整合，去除重复项,最终得到自身免疫性心肌炎的潜在靶点。

1.3 交集靶点的筛选

利用Venn分析对氯沙坦潜在的靶点和自身免疫性心肌炎的潜在靶点进行分析，得到共同的交集基因，即为氯沙坦对自身免疫性心肌炎的预防和治疗作用的潜在靶点。

1.4 “药物-靶点-疾病”调控网络、PPI的构建

运用Cytocape3.8.2软件将所得的靶点构建为“药物-靶点-疾病”调控网络。使用 STRING 平台构建蛋白-蛋白相互作用网络(PPI),物种设为“Homo sapiens”,即“人类”。“Medium confidence”阈值设为0.4,并隐藏孤立节点。利用软件 Cytoscape 3.8.2 对 PPI 网络进行拓扑网络分析, 筛选Betweenness Centrality、Closeness Centrality、Degree大于中位数的靶点作为PPI网络的核心节点。

1.5 关键基因富集分析集KEGG通路图绘制

将P值及矫正后的P值均设置为0.05, 对获得的靶点进行GO和KEGG富集分析,选取生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)各自前10位、富集前20位通路绘图。将交集靶点上传至KEGG数据库,选择与本课题最为相关的通路,使用mapper工具构建KEGG通路图。

2 结果 

2.1 氯沙坦及自身免疫性心肌炎的靶点获取

结合pharmmapper数据库预测靶点结果共获取氯沙坦潜在药物靶点147个。从GeneGards数据库中筛选得到自身免疫性心肌炎的780个潜在靶点。从DisGeNET数据库中筛选得到自身免疫性心肌炎的63个潜在靶点。从OMIM数据库中筛选得到自身免疫性心肌炎的190个潜在靶点,去除重复靶点然后合并,一共得到自身免疫性心肌炎的1028个潜在靶点。氯沙坦潜在药物靶点靶点和自身免疫性心肌炎的潜在靶点合并,得到39个交集基因,预测为氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的靶点，结果如图1示。

图1   药物-疾病靶点韦恩图

2.2 构建网络图

2.2.1 药物-靶点-疾病网络构建

以39个交集基因作为氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的靶点,建立氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的药物-靶点-疾病网络图。节点代表氯沙坦,边代表了氯沙坦与靶点的相互作用，结果见图2。网络图充分体现了氯沙坦多靶点治疗自身免疫性心肌炎的机制。

图2   药物-靶点-疾病网络图

注:1个药物节点(圆形)、39个交集靶点(菱形)

2.2.2 潜在靶点PPI网络分析

利用STRING平台构建39个交集基因的PPI网络, 将结果输入软件Cytoscape 3.3.0中进行可视化处理。在PPI网络图中,共有38个节点,188条边,如图3所示,节点颜色从深绿到浅黄代表重要程度递减,内圈为核心靶点。根据网络拓扑属性值筛选后,该PPI网络度值最高的前10位的靶点依次为MMP9、CASP3、MMP2、ACE、REN、PPARG、MAPK14、IL2、HMOX1、MMP3, 说明它们很可能是氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的关键基因。

图3   PPI 网络图

3 氯沙坦靶点治疗自身免疫性心肌炎的 GO、KEGG 分析

对39个交集基因进行分析后, 一共获得142条生物过程(BP),42条分子功能(MF), 21条细胞组分(CC),按FDR值由小到大排序，在图4分别展示了BP、MF、CC的前10位绘制柱状图。排名前10位的生物过程为蛋白水解作用、信号转导、凋亡过程的正向调节、凋亡过程、RNA聚合酶II启动子的转录正调控、基因表达的正向调控、缺氧反应、对外源刺激的反应、细胞内信号转导、凋亡过程的负调控。排名前10位的分子功能为蛋白质绑定、锌离子结合、相同蛋白结合、肽酶的活动、RNA聚合酶II转录因子活性、丝氨酸型内肽酶活性、受体结合、DNA结合、ATP绑定、肽链内切酶的活动。排名前10位的细胞组分为细胞外区域、胞质、核、细胞质、细胞外空间、质膜、核浆、细胞外外来体、内质网腔、质膜外侧面。KEGG通路富集分析得到97条通路, 研究展示了以Count值为基础的前20条通路。39个交集基因主要富集在IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、T细胞受体信号通路、TNF信号通路、松弛素信号通路等信号通路,此外,其结果表明这些靶点可能参与癌症、糖尿病性心肌病、血脂与动脉粥样硬化等疾病的病理过程,结果在图5中展示。KEGG富集分析结果中,共有8个交集基因富集在IL-17信号通路上:MAPK1、MAPK8、MAPK14、MMP3、MMP9、CASP3、LCN2、S100A9，结果如图6所示。

4 讨论

心肌炎是一种以心脏炎症为特征的严重疾病,被认为是全球儿童和年轻人心脏性猝死的主要原因。大多数心肌炎患者会康复,但其中约9.3%～21%的患者会

图4   GO富集分析结果

图5   KEGG富集分析结果

图6   IL-17信号通路KEGG分析结果

逐渐发展为慢性心肌炎、扩张型心肌病和充血性心力衰竭。心肌炎的病理生理过程包括病原体引起的直接损伤以及随后的免疫反应导致的组织损伤。目前研究表明,自身免疫介导的心脏损伤在心肌炎的发病机制中起着重要作用。因此,在自身免疫异常的基础上明确导致心肌炎的机制,并在支持治疗的基础上开发有效的治疗方法是十分必要的[6]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂罗格列酮可以减少IL-17的表达，从而明显减轻实验性自身免疫性心肌炎病情,抑制心肌炎症反应[11]。研究表明,替米沙坦显著降低实验性自身免疫性心肌炎的内质网应激标志物,表明替米沙坦至少部分是通过抑制炎症细胞因子和氧化应激减轻了自身免疫性心肌炎[12]。ATII受体拮抗剂沙坦类药物可抑制实验性自身免疫性心肌炎的TNF-α、IFN-γ等炎症因子的表达，转变Th1/Th2细胞因子的平衡和减轻细胞氧化应激反应，明显降低心肌炎症的严重程度，同时明显改善了心功能。因此，ATII可能是 实验性自身免疫性心肌炎发生的重要因素，抑制 ATII能够有效缓解心肌炎症损伤[13]。因此,本文采用生物信息学和网络药理学的分析方法,预测分析氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎的潜在的治疗靶点和作用机制。

本研究中得到氯沙坦治疗自身免疫性心肌炎潜在靶点共39个,其中包含了MMP9、CASP3、MMP2、ACE、REN、PPARG、MAPK14、IL2、HMOX1、MMP3十个核心靶点，这说明氯沙坦可能通过多靶点治疗的方式延缓自身免疫性心肌炎的进展。根据 GO、KEGG 富集结果,发现氯沙坦可能通过蛋白水解作用、信号转导、凋亡、RNA聚合酶II启动子的转录正调控、基因表达的正向调控等生物进程,并结合酶、锌离子、蛋白质等分子发挥作用。其作用机制主要与 IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、T细胞受体信号通路、TNF信号通路等通路有关。

本文通过对氯沙坦作用靶点的筛选,发现氯沙坦可以通过多种途径在自身免疫性心肌炎方面的发挥治疗功效,是多种靶点及通路共同作用的结果。未来需要结合网络药理学结果,针对性的进行相关的细胞、动物、药理实验,为治疗自身免疫性心肌炎提供更多的可靠依据。

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