基于网络药理学及分子对接的夏枯草-玄参治疗亚急性甲状腺炎的作用机制

摘要：目的 基于网络药理学及分子对接技术，探讨夏枯草-玄参治疗亚急性甲状腺炎（SAT）的活性成分及其潜在的分子机制。方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台与Uniprot 数据库筛选夏枯草-玄参的活性成分及其相关靶点蛋白并对基因名称进行标准化；通过GeneCard 数据库、DisGeNET数据库、OMIM数据库、MalaCards等数据库,查找亚急性甲状腺炎（SAT）相关靶点；将交集靶点输入STRING数据库构建PPI可视化网络图，对其进行拓扑结构分析及核心靶点筛选；采用GO及KEGG对相关靶点及通路进行富集化分析；利用Cytoscape3.8.2软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络后；采用AutodockTools1.5.6、Pymol进行分子对接及可视化。结果 筛选得到槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷固醇和豆甾醇等为夏枯草-玄参的主要活性成分；GO富集分析得出2638个条目、生物过程2401条、细胞组成71个、分子功能166个；KEGG分析涉及167条信号通路。分子对接显示SAT的五个主要活性成分与AKT1、TP53、TNF、CASP3、IL6受体蛋白和配体之间结合良好。结论 夏枯草- 玄参可能通过多成分、多靶点、多通路发挥治疗亚急性甲状腺炎的作用。

关键词：亚急性甲状腺炎；夏枯草；玄参；网络药理学；分子对接

中图分类号：R259

Exploring the mechanism of Prunella vulgaris -Scrophularia ningpoensis in the treatment of subacute thyroiditis based on network pharmacology and molecular docking

WEN Tingting1   HUANG Xinzhu1   LI Shanshan2(corresponding author)

1.Guizhou University of Chinese Medicine, Guizhou Guiyang 550000

2.The Second Affiliated Hospital of Guizhou University of Chinese Medicine, Guizhou Guiyang 550000

Abstract: Objective To explore the active ingredients and potential molecular mechanisms of Prunella vulgaris and Scrophulariaceae in treating subacute thyroiditis (SAT) based on network pharmacology and molecular docking technology. Methods The active ingredients of Prunella vulgaris and Scrophulariaceae and related target proteins were screened through the Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform and the Uniprot database, and the gene names were standardized; the GeneCard database, DisGeNET database, OMIM database, MalaCards and other databases were used to search. Targets related to subacute thyroiditis (SAT); input the intersection targets into the STRING database to construct a PPI visual network diagram, conduct topological structure analysis and core target screening; use GO and KEGG to enrich related targets and pathways Analysis; after using Cytoscape3.8.2 software to construct the "drug-component-target-disease" network, AutodockTools1.5.6 and Pymol were used for molecular docking and visualization. As a result, quercetin, kaempferol, luteolin, β-sitosterol and stigmasterol were screened and found to be the main active ingredients of Prunella vulgaris - Scrophulariaceae; GO enrichment analysis revealed 2638 entries, 2401 biological processes, and cell composition. 71, 166 molecular functions; KEGG analysis involves 167 signaling pathways. Molecular docking showed that the five main active components of SAT bind well to AKT1, TP53, TNF, CASP3, IL6 receptor proteins and ligands. Conclusion Prunella Vulgaris and Scrophulariaceae may play a role in treating subacute thyroiditis through multiple components, multiple targets and multiple pathways.

Keywords: subacute thyroiditis; Prunella vulgaris; Scrophulariaceae; network pharmacology; molecular docking.

亚急性甲状腺炎（subacte thyroiditis，SAT）简称亚甲炎，是一种自限性炎症性甲状腺疾病，临床特征为颈前疼痛，可辐射至耳朵和下巴[1]。目前其发病机制尚不明确，认为多与病毒感染有关。本病30-50岁的女性为高发人群，男女发病比例约为1：4.3，发病率亦逐年升高[2]。西医治疗SAT的药物以糖皮质激素或它非甾体类抗炎药物为主，可有效缓解症状，但副作用大、复发率高。对于容易出血的患者、骨质疏松患者、哺乳期妇女或妊娠期妇女，需谨慎使用。且一旦停药，极易出现停药后反跳现象。中医药治疗SAT安全性更高，对于改善症状、缩短病程，减轻激素反作用和停药反应、降低复发率有优势。本研究通过网络药理学及分子对接技术，探论夏枯草-玄参治疗亚甲炎（SAT）的作用机制。亚甲炎（SAT）在传统医学属“瘿病”范畴，其病因与情志、饮食、体质等相关。甲状腺属于人体最大的内分泌腺体，其合成的甲状腺激素具有促进机体正常生长发育、调节各器官系统功能、促进新陈代谢等作用。肝主疏泄，喜调达而恶抑郁，故凡精神情志之调节，均与肝密切相关。甲状腺分泌的甲状腺激素可有效提升神经系统兴奋性，进而影响机体情绪。从SAT发病机制及病理特点来看，其病机为外感风邪兼内有郁火，外风与内火相合，风火相煽，最终聚于甲状腺部位起病，两者缺一不可。风与火皆为阳，其性炎上，风火两邪交于体内，一易化燥伤阴产生温燥之邪；二可使内伏之郁火化热生风，导致肝阳上亢无制；三易扰乱心神，使机体神无所主。甲状腺居于人体高位，位置表浅，易受风邪侵袭，故甲状腺受邪常与风邪密切相关。风邪首犯肺卫，咽喉为肺之门户，甲状腺位于咽喉部，故风邪易侵袭甲状腺，可见咽痒咽痛、咳嗽、甲状腺疼痛。风性主动，其致病之病位常游走不定，故SAT具有“动”的临床表现，疼痛常由一侧转移到另一侧，且常向颈部、颌下、耳后放射。风性轻扬开泄，风邪侵袭肌表，皮毛腠理开张，出现恶风、发热、汗出。这些症候又与SAT上呼吸道感染症状相应。中药治疗瘿病的历史悠久，且具有独特的优势。夏枯草（Prunella vulgaris L.）味苦、辛,性寒,归肝、胆经,具有清肝散火、明目、散结消肿的功效[3]，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎，调节免疫及抗心血管疾病等作用。玄参（ Scrophularia ningpoensis Hemsl.）具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结之功[3]，具有抗血小板聚集、抗炎、抗氧化等药理作用[4]。基于中医传承辅助系统分析中医药治疗甲状腺功能亢进症方剂组方规律，从210首方剂、249中药味和使用频次20次以上为条件筛选后发现，夏枯草-玄参为治疗瘿病的常用药对[5]，本文基于网络药理学及分子对接探讨夏枯草-玄参治疗SAT的作用机制，为临床治疗提供新思路和相关实验提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 亚急性甲状腺炎相关靶点获取

首先利用在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）、GeneCard 数据库、DisGeNET数据库、MalaCards人类疾病数据库,以“Subacute thyroiditis” 为关键词进行搜索，获取亚急性甲状腺炎相关靶点信息,然后利用Uniprot 数据库对基因名称进行标准化处理。

1.2 药物-成分-靶点网络的构建

通过GeneCard 数据库、DisGeNET数据库、OMIM数据库、MalaCards等数据库获取亚甲炎（SAT）的相应靶点；取亚甲炎（SAT）相关靶点与药物活性成分的交集靶点。通过Cytoscape 3. 8. 2 构建“药物-成分-靶点”网络图。

1.3 构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络并分析

将交集靶点导入STRING11.5数据库，以“Homo 

表1   中药主要活性成分一览表

sapiens”进行物种设置，以TSV 格式将结果输入Cytoscape3.8.2，构建PPI网络图进行拓扑结构分析并筛选出核心靶点。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

中药治疗亚甲炎的潜在靶点通过R软件用clusterProfiler包进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析, 设置pvalueCutoff =0.05, qvalueCutoff = 0.05，并将排序靠前的结果进行可视化分析。

1.5 分子对接

从RCSBPDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载pdb结构。从TCMSP数据库获取对接小分子库。首先，由AutodockTools1.5.6对pdb结构进行去水、加氢操作，并进行受体结构准备工作。

2 结果

2.1 中药相关化学成分查找及靶点获取

见表 1。按照上述方法筛选，2味中药共收集到19个活性成分，218个靶点基因。

2.2 中药作用于亚甲炎（SAT）的靶点预筛选及药物-成分-靶点网络图的构建

见图2、图1。亚甲炎（SAT）1954个治疗靶点，与218个夏枯草-玄参活性成分相关靶点取交集，获得140个潜在靶点；网络图中包括157个节点。结果表明槲皮素、豆甾醇、木犀草素、山奈酚，β-谷固醇连接度较高。其中β-谷固醇为夏枯草、玄参共有成分,我们推测上述化合物可能是中药治疗亚甲炎（SAT）的关键成分。

图1   药物-疾病韦恩图

图2   药物-成分-靶点-疾病网络图

表2   中药治疗亚急性甲状腺炎的潜在核心靶点信息

图3   PPI网络图

图4   基于cytoHubba核心靶点网络图

2.3 PPI网络

中药治疗亚急性甲状腺炎的潜在作用靶点PPI网络（图 3）,此网络图节点为139个，边为5936条，平均度值为42.705，而EIF6排除在外，图中节点的大小及其颜色的深浅与其度值成正比。采用Cytoscape的cytoHubba插件，基于度值计算，得到中药治疗亚急性甲状腺炎的关键靶点为AKT1、TP53、TNF、CASP3和IL6（图 4）。

2.4 GO功能分析

见图5。

图5   中药治疗亚急性甲状腺炎的GO功能富集分析

2.5 KEGG通路分析

中药治疗亚急性甲状腺炎的KEGG通路分析图（图6），可以看出， PI3K−Akt信号通路（图 7）、TNF信号通路、IL-17信号通路等可能是中药治疗亚急性甲状腺炎的关键通路。

图6   KEGG通路分析

图7   信号通路图

图4 A:GO功能富集分析；B:KEGG通路分析；C:PI3K−Akt信号通路图

2.6 分子对接结果

见表3。分子对接结果显示，药物成分与靶点有良好对接活性。配体槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷固醇和豆甾醇与受体AKT1、TP53、TNF、CASP3、IL6结合活性良好，其中结合能最大值为-8.4，结合能最小值为-5.9。

图8   A：AKT1_槲皮素;B: CASP3_山奈酚;C: TP53_木犀草素

表3   分子对接（单位：kcal/mol）

3 讨论

SAT发病机制尚不明确，现代研究认为与病毒感染关系密切[6]。亚急性甲状腺炎（subacute thyroiditis，SAT）又称肉芽肿性甲状腺炎、巨细胞性甲状腺炎，是一种与病毒感染相关的自限性甲状腺炎症[7-8]，临床主要表现为甲状腺肿大触痛、红细胞沉降率（ESR）增快、摄碘量降低等[9]。西医早期治疗以非甾体类抗炎药为主，病情重者以糖皮质激素为主，总疗程一般不少于6～8周，过快减量、过早停药易致病情反复[10]。SAT可归属于中医学“瘿瘤”“瘿肿”范畴，中医分型分期论治本病疗效明显，优势突出[11]。研究发现，夏枯草-玄参为治疗瘿病的常用药对。玄参始载于《神农本草经》：“味苦，微寒。”《药性论》曰：“能治暴结热，主风热头痛，伤寒劳复，散瘤瘿瘰疬。”现代药理研究显示，玄参具有保护心脑血管系统、抗炎镇痛、增强免疫等药理作用[13]。

本研究通过网络药理学及分子对接技术分析其作用机制,结果显示,夏枯草-玄参治疗SAT共有19个活性成分起关键作用。 槲皮素(Quercetin)是从芦丁中提取的一种多羟基黄酮类化合物，具有抗氧化及清除自由基、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降糖及免疫调节等药理作用[14-15]。研究表明，槲皮素可改善甲状腺功能，对甲亢有治疗作用[16]。

木犀草素( Luteolin) 是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等多种药理作用[17-18]。木犀草素可抑制TNF-α、IL-6水平的上升，促进IL-4水平的升高，从而抑制炎症反应[19]。山奈酚是一种天然类黄酮化合物，具有抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血糖和降血脂的作用[20-21]。

本次研究通过网络药理学及分子对接技术得出夏枯草-玄参治疗亚甲炎（SAT）排名前五的靶点为AKT1、TP53、TNF、CASP3和IL6[22-24]。IL－6 通过调节细胞的生长和分化，参与炎症和免疫反应过程[25-26]。CASP3具有使DNA断裂、B 细胞活化、抗原呈递、免疫反应、趋化因子受体和炎症功能[27-28]。TNF信号通路是与炎症反应、免疫应答及细胞凋亡相关的重要通路[29-30]。研究表明，IL-17在慢性炎症现象，组织损伤和纤维化的发病机制中起主导作用[31],且可激活NF-κB通路上调IL- 6的表达，上调甲状腺细胞中程序性细胞死亡配体1的表达，加速炎症浸润，促进肿瘤发展[32]。因此，夏枯草-玄参可能通过炎症反应、免疫应答、调节细胞周期与甲状腺激素水平等途径治疗亚甲炎（SAT）。

本研究为临床应用夏枯草-玄参治疗亚甲炎（SAT）提供了实验证据，并为今后的相关实验提供了理论基础。而中药在配伍后进行煎煮或提取成分后可能会有成分上的改变；数据库更新、包含程度和收集遗漏等会使中药成分有所变化，因而需要开展进一步的研究补充完善。

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