基于指纹图谱及化学模式识别的保胎灵胶囊的质量评价

摘要：目的 以保胎灵胶囊高HPLC指纹图谱检测方法，采用化学模式识别技术对保胎灵胶囊进行综合评价。。方法 使用Agilent Poroshell 120 SB-C18（100mmm*2.1mm，1.8um）色谱柱进行分析。流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，采用梯度洗脱，流速为0.3mL/min。检测波长为230nm，柱温设定为30℃。通过高效液相色谱（HPLC）技术，对22批保胎灵胶囊进行指纹图谱检测。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以芍药苷为参考峰，鉴定共同的峰并进行相似度评价。基于变量重要性投影（VIP）值大于1的标准，筛选出对制剂质量有影响的差异标志物。结果   22批次保胎灵胶囊指纹图谱大于0.9；指认了6个成分及药材归属，其中色谱峰4号峰、5号峰（芍药苷）、6号峰归属白芍，色谱峰 1号峰（马钱苷酸）、3号峰（獐牙菜苷）归属续断，色谱峰 9号峰（五味子醇甲）、10号峰（五味子醇乙）、11号峰（五味子甲素）、12号峰（五味子乙素）归属五味子。聚类分析（CA）和主成分分析（PCA）结果显示4个厂家的保胎灵胶囊分别聚成一类，正交偏最小二乘判别分析（PLS-DA）结果显示五味子醇甲,五味子甲素,五味子醇乙, 五味子乙素,峰8，峰7对应成分的VIP值均大于1 结论 建立保胎灵胶囊的指纹图谱可用于评价该制剂的整体质量；芍药苷等6个成分是影响保胎灵胶囊质量的差异标志物。

关键词：保胎灵胶囊；指纹图谱；化学模式识别；质量评价；相似度；主成分分析；聚类分析

中图分类号：R714

保胎灵胶囊收载于国家药品标准（新药转正标准中药第七十七册），具有补肾，固冲，安胎的功效，临床上用于先兆流产，习惯性流产及因 流产引起的不孕症[1]。文献报道，保胎灵胶囊与西医结合，能显著地改善早期先兆流产的临床表现，并能增加黄体酮含量，是一种安全的药物，不良反应较小[2-4]。2016年国家实施“二胎政策”以来，保胎用药的市场应用前景大，使用率逐年上升。

保胎灵胶囊出自清代名医张锡纯创立的寿胎丸，后经加减而成现代中药制剂。是由菟丝子，五味子，白芍，熟地黄等14味中药组成的复方制剂，目前，针对保胎灵胶囊多集中在临床研究，对其化学成分和物质基础方面研究非常薄弱，现行标准也仅对白芍中芍药苷做出了明确要求，指纹成分较单一，无法全面评价药品整体质量。近几年来，基于模式识别的中药指纹图谱技术在中药材质量控制、来源分析及差异标志物等领域得到了越来越多的应用，可以有效地弥补目前质控手段的缺陷[5]。因此，拟采用结合聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（PLS-DA）相结合的方式，构建保胎灵胶囊的指纹图谱，对12个共有峰成分中批间差异较大的成分进行筛选，为产品质量均一性及临床安全用药提供参考[6-11]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1290 InfinityⅡ超高效液相色谱仪（美国Aglient公司）；8510J-DTH超声波清洗器（日本大和YAMATO科技股份有限公司）；AG204电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q 纯水仪(美国Millipore公司)。

1.2 材料

对照物：选用白芍药苷（标号为110736-202145，含量约为94.6%）、斑蝥酸（标号为111865-202005，纯度为97.5%）、吴茱萸醇甲（标号为110857-201815，纯度高达99.7%）、吴茱萸甲素（标号为110764-201915，纯度为99.5%）及吴茱萸乙素（标号为110765-201813，含量为99.1%）这些元素均是从中国国家食品药品监督管理局旗下的检测研究所购得。另外，对于獐牙菜素（标号：wkq21060110）和五味子醇乙（标号：wkq21102209），则是由位于四川的维克奇生物技术公司提供。乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯；水为超纯水。保胎灵胶囊供试品覆盖了4个厂家 22 批次，样品信息见表 1。

对照药材   白芍（批号：120905-201610）、续断（批号：121033-201812）、五味子（批号：120922-201610）均购自中国食品药品检定研究院。

表1   保胎灵胶囊的样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

所用的色谱分析仪采用了安捷伦科技的Poroshell 120 SB-C18色谱柱（尺寸为100mm×2.1mm，颗粒大小为2.7μm）。配制流动相由乙腈和含0.1%甲酸的去离子水按比例混合制得，并通过梯度程序进行洗脱，洗脱顺序如下：在初始至20min时间内，从5%乙腈递增至25%；接下来的10分钟内（即20至30min），液相中乙腈比例提高至45%；随后的20min（即30至50min），乙腈浓度进一步升至70%；在50至51min时段，迅速提升至95%乙腈并维持至第62min结束。整体流动速率维持在每分钟0.3mL/min。同时，此色谱方法的检测波长设定为230nm，色谱柱温度控制在30摄氏度，而注入色谱柱的样品体积为5 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备   

精密称取马钱苷酸，獐牙菜苷对照品，芍药苷对照品，五味子醇甲对照品，五味子醇乙对照品，五味子甲素对照品和五味子乙素对照品适量，分别加 50%甲醇制成质量浓度马钱苷酸0.35mg/ml、獐牙菜苷0.29mg/ml、芍药苷0.32mg/ml、五味子醇甲0.28mg /ml、五味子醇乙0.27mg/ml、五味子甲素0.36mg/ml和五味子乙素0.16mg/ml的溶液。

2.2.2 供试品溶液   

将该产品重量偏差表中之内容，研磨至2克，精确称量；置具塞的烧瓶内，精确加入25毫升50%的甲醇水，密塞，称量，超声波（功率100瓦、频率48 kHz)60分钟，冷却后再次称量，用50%的甲醇溶液补充减失量，摇动、过滤，取出续滤液，即可得到待测品溶液。

2.2.3 对照药材溶液

取白芍0.5 g、续断0.5 g、五味子对照品0.5 g，精确称量，用“2.2.2”法配制供试品溶液。

2.3 方法学的考察

2.3.1 精密度试验

用同一批次的包胎灵胶囊（批号19080101)，按“2.2.2”项下的步骤进行6次测量。以6号峰为参照峰，分别测定了各个色谱柱的相对保留时间，计算各共有峰相对保留时间的 RSD≤1.0％ ，相对峰面积的RSD≤4.0％ ，结果显示该方法具有较好的精密度。

2.3.2 稳定性试验

取同一批保胎灵胶囊粉末（批号 19080101），按照“2.2.2”项方法操作，分别在0，4，8，12，16，20，24 h 测定其指纹图谱，用6个峰位作为参考峰，分别测定了6个主要色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，发现每个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD为1.2%, RSD≤4.8%。

2.3.3 重复性试验

取同一批次的保胎灵胶囊（批号19080101)，按“2.2.2”项下的步骤，分别配制6个样品，用6个峰的保留时间作为参考峰，计算出每个共有峰的相对保留时间， RSD≤1.5%, RSD≤5.0%，证明该方法具有较好的重现性。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度计算

取22 批次保胎灵胶囊样品，按照“2.2.2” 项方法操作，按照上述方法进行测量，引入2012版《中药指纹图谱相似性评估体系》，参考S16作为参考，利用中间值、0.3的时间窗口、 Mark-峰值匹配模式，产生控制图谱并进行平均值计算，得到控制指纹图谱。每一批（S1-S22）与控制指纹图进行了对比，其相似性值在0.871-0.990之间，从表中看出同一厂家批间差异较小，但不同厂家差异较大。22批样品的叠加指纹图谱见图1

图1   22批保胎灵胶囊HPLC叠加指纹图谱

表2   22批样品相似度结果

2.3.5 保胎灵胶囊共有峰的确认与归属

经过与标准样品及相应的药用植物材料对照分析，成功确认了6种活性成分的峰位以及其所对应的草药来源，整体共鉴定了12种共有色谱峰。具体来说，色谱中的第4、5（代表芍药苷）、6个峰鉴定为来源于白芍。第1（马钱苷酸）、3（獐牙菜苷）个峰则对应于续断。而第9（五味子醇甲）、10（五味子醇乙）、11（五味子甲素）、12（五味子乙素）号峰显然源自五味子。见图2～3。

图2   共有模式对照图谱

1：马钱苷酸     3：獐牙菜苷    5：芍药苷    9：五味子醇甲10：五味子醇乙   11：五味子甲素   12：五味子乙素

A：续断对照药材      B：白芍对照药材      C：五味子对照药材     D：样品   E：混合对照品

图3   混合对照品及药材的归属

2.3.6 聚类分析（CA） 

将22批次保胎灵胶囊数据导入MPP软件，进行聚类分析，结果显示4个厂家的保胎灵胶囊分别聚成一类，聚类分析结果见图4。

图4   22批次保胎灵胶囊聚类分析（CA）

2.3.7 主成分分析（PCA）

22批次保胎灵胶囊12个共有峰峰面积数据导入MPP软件，用正交偏最小二乘法-判别分析程序，建立PLS-DA模型(模型自动拟合成3个主成分,累积贡献率为70%'),表明预测结果可信度高。根据分析结果，构建主成分分析图和三维图，4个厂家的保胎灵胶囊各自聚为一类，与聚类分析结果一致，见图5～6。

图5   22批次保胎灵胶囊主成分分析（PCA）

图6   22批次保胎灵胶囊三维图

2.3.8 差异性成分分析

模型中变量重要性投影值（VIP值）可直观体现4个生产厂家的差异性成分，VIP值大于1的化合物对分类概括解释率大于50%，对分类结果具有统计学意义，即为差异标志物。由图7可知，五味子醇甲,五味子甲素,五味子醇乙, 五味子乙素,峰8，峰7均大于1.0，为不同厂家保胎灵胶囊的差异性成分。A厂家的差异性颜色与其他三个厂家差异较大，与相似度的结果一致。

注：1.五味子醇甲     2.五味子甲素    3.五味子醇乙     4.五味子乙素    5.峰8    6.峰7      7.峰4       8.獐牙菜苷      9.峰6    10：芍药苷    11：马钱苷酸   12：峰2

图7   保胎灵胶囊差异性标志物的VIP值

3 讨论

3.1 色谱条件的确定

本实验通过评估多种不同浓度和组合的洗脱剂，涉及了乙腈混合0.1%的磷酸溶液、乙腈混合0.2%的磷酸溶液、乙腈混合0.1%的甲酸溶液以及甲醇混合0.1%的甲酸溶液等多种流动相比例。仿效标准操作程序，特别关注在乙腈与0.1%的磷酸水溶液结合使用时的系统表现，色谱图基线平直，色谱峰数目多并且分离度较好。

3.1检测波长的选择

本实验采用二极管陈列检测器，在波长200~400nm扫描，对 218、230、250、312 nm不同波长进行考察，当波长为 230 nm所得色谱图不论在色谱峰数目及色谱峰强度上均优于其他波长处色谱图，故确定230nm作为检测波长。

3.2 样品处理方法优化

在此基础上，研究了不同提取方式（热回流、超声波），并研究了溶剂类型（甲醇、水、乙醇）、萃取体积、有机相甲醇比例（30%,50%,70%)，提取时间等因素对提取效果的影响。最终确定最佳处理方法为 50%甲醇25 mL，超声提取 30min。

3.3 PCA、CA 和 PLS-DA

研究利用色谱指纹技术并辅以化学模式识别策略，观察到市场上不同生产商生产的保胎灵胶囊在质量上表现出了显著的异质性，同时发现即使是相同生产商不同批次生产的产品，也存在细微的质量变化。通过聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）以及偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等方法的综合应用，将研究对象的22个批次制剂分为四个不同的类别，并从中成功鉴定出6个关键的差异性质量标志物，分别指认为9（五味子醇甲）、11（五味子甲素）、10（五味子醇乙）、12（五味子乙素）、 8号， 7号峰。因此，企业应加强对该6项品质指标的监测，并对其在各制造阶段的变动进行追踪，从而实现对该产品的更为科学和完整的管理。本实验中 PCA、CA 和 OPLS-DA 法结果基本一致，与相似度评价结果互为佐证，从VIP值可以看出五味子作为各厂家间差异较大的药材，本课题对于其限度后续将会进行进一步的研究，目的是为制定更为科学的量化指标提供依据。该研究将为中药材的品质监控研究开辟一条新的途径，为企业从原料来源，加工方式，运输储存等方面，提供了一种新的方法。在萃取处理、制剂选用等过程中，对制剂的质量进行更加科学和系统的控制。

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基金项目：浙江省药品监管系统科技计划项目“保胎灵制剂的标准提升与质量控制”（编号：2022022）