生理盐水加热法在恢复收缩淋巴组织HE形态中的应用研究

摘要：目的：探讨生理盐水加热法在恢复收缩淋巴组织形态中的应用价值。方法：挑选临床淋巴组织病例30例，拟定四组切片，常规切片与用生理盐水、柠檬酸盐缓冲液及EDTA溶液高温加热后的切片进行比较研究，分别观察四组切片的HE染色效果和形态变化。结果：30例病例中，未经处理的切片明显形态和染色效果最差，生理盐水处理后的切片有30例均有明显改进，切片恢复率100%（30/30），柠檬酸盐缓冲液处理后的切片恢复率66.7%（20/30），EDTA溶液处理后的切片恢复率50%（15/30），恢复效果依次是生理盐水＞柠檬酸盐缓冲液＞EDTA溶液＞常规未处理。结论：浸泡高温修复确实能恢复收缩淋巴组织细胞形态，其中生理盐水比抗原修复液更适合于形态修复，在临床具有实用价值。

关键词：生理盐水；收缩；淋巴组织

中图分类号：R55

淋巴瘤是所有病理诊断中最困难的领域，淋巴组织病变误诊率很高，有时甚至会引起医疗纠纷。导致误诊的原因很多，其中淋巴组织切片不合格是主要原因,正确的病理诊断离不开一张优良的组织切片[1]。淋巴组织结构致密，细胞成分丰富，间质少，部分淋巴组织外周常包绕着一层质密的结缔组织被膜，给组织固定带来困难，再加上常规采用甲醛固定剂，经乙醇脱水后本身收缩较大，多用于淋巴组织固定的B-5固定液推广到基层医院也较难实现，故在不改进固定等常规环节的情况下，参考免疫组织化学染色在染色前单独对切片进行修复处理的前提下，本研究重点讨论哪种修复液在修复其形态方面有较大优势。

1 材料与方法

1.1 材料

收集丰都县人民医院病理科近两年外检中淋巴组织因为固定不佳引起组织收缩的病例30例，每个病例活检蜡块薄切（2.5μm）4张切片。

1.2 仪器设备

美的电磁炉，耐高温塑料架3个。

1.3 试剂

本次研究所采用试剂均为成品，湖南汉森制药有限公司生产的生理盐水；购自福州迈新公司的EDTA溶液（0.01mol/L PH9.0）和柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）。

1.4 方法

将薄切2.5um的淋巴组织切片脱蜡。然后进行修复处理，分4组进行，分别是常规未处理、生理盐水、柠檬酸盐缓冲液及EDTA溶液高温处理，将3组切片各30张分别浸泡于盛有3种溶液的锅中分别置电磁炉上加热至沸腾，并计时保持10min，待自然冷却后取出切片，进行HE染色。将4组制好的淋巴组织切片根据HE评分标准进行评分，最后统计及分析。

第一组方法：按照临床技术操作规范（病理学分册）苏木精-伊红（HE）染色步骤进行[20]。         

 第二组方法：烤片（1h）→二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→无水乙醇（3min）→95%酒精（30min）→85%酒精（3min）→水洗（35s）→放入盛有生理盐水的容器内，生理盐水完全浸泡住载玻片上的组织，放入电磁炉，当气压达到70kpa，倒计时2min后放气，拿出切片自然冷却→苏木素（14min）→流水冲洗（3min）→1%盐酸酒精（8-10s）→水洗（35s）→饱和碳酸锂（1min）→水洗（35s）→伊红（1min）   水洗（35s）→85%酒精（30s）→95%酒精（30s）→无水乙醇（30s）→环保透明剂（1-2min）→中性树胶封固。

第三组方法：烤片（1h）→二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→无水乙醇（3min）→95%酒精（30min）→85%酒精（3min）→水洗（35s）→放入盛有柠檬酸盐缓冲液的容器内，柠檬酸盐缓冲液完全浸泡住载玻片上的组织，放入高压锅，当气压达到70kpa，倒计时2min后放气，拿出切片自然冷却→苏木素（14min）→流水冲洗（3min）→1%盐酸酒精（8-10s）→水洗（35s）→饱和碳酸锂（1min）→水洗（35s）→伊红（1min）→ 水洗（35s）→85%酒精（30s）→95%酒精（30s）→无水乙醇（30s）→环保透明剂（1min）→中性树胶封固。

第四组方法：烤片（1h）→二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→无水乙醇（3min）→95%酒精（30min）→85%酒精（3min）→水洗（35s）→放入盛有EDTA溶液的容器内，EDTA溶液完全浸泡住载玻片上的组织，放入高压锅，当气压达到70kpa，倒计时2min后放气，拿出切片自然冷却→苏木素（14min）→流水冲洗（3min）→1%盐酸酒精（8-10s）→水洗（35s）→饱和碳酸锂（1min）→水洗（35s）→伊红（1min）→水洗（30s）→85%酒精（30s）→95%酒精（30s）→无水乙醇（30s）→环保透明剂（1-2min）→中性树胶封固。

2 结果

收缩的淋巴细胞恢复到正常形态，核膜、染色质及核仁等细胞结构清晰显示。实际工作中由2名病理主治医师分别阅片，4组淋巴结收缩切片对比阅片结果显示，第1组未经处理的切片（图一），细胞结构不清晰、有收缩、核质颜色对比不明显，切片恢复率0%（0/30）。经过处理的切片镜下细胞变大至约新鲜淋巴组织细胞大小、细胞核的染色质及核仁明显变清晰：第2组生理盐水处理的切片，30张切片均有明显改善，可诊断，切片恢复率100%（30/30）；第3组柠檬酸盐缓冲液，30张切片有20张恢复，可诊断，切片恢复率66.7%（20/30）；第4组EDTA溶液，30张切片有15张恢复，可诊断，切片恢复率50%（15/30）。收缩的淋巴组织，在上述不同修复液修复后，可诊断的切片均恢复到正常形态（图二）。

图1   未经处理的淋巴组织HE

图2   经处理的淋巴组织HE

3 讨论

在全身系统组织疾病的临床病理诊断中，对淋巴组织的病理诊断一致认为疑难程度最高[2]，即病理医师对淋巴瘤的诊断感到困难最大[3]，其原因除淋巴结病变本身的复杂性外，主要还是由于淋巴组织切片前处理及切片质量较差所致。同时又常常因为人为因素，而导致许多不该出现的“疑难”病例，淋巴组织的处理及切片的优劣直接影响着病理诊断的及时性、准确性，影响着病人的预后。质量差的淋巴组织切片比其他组织更容易造成假象而导致误诊，有时甚至会引起医疗纠纷。淋巴组织病理诊断误诊率高达10%-30%，其中切片因素占多数[4]。由此可见，我们要去认识淋巴组织病变的前提是要做好淋巴组织切片，良好的组织切片是淋巴组织病变诊断的基础，特别重要。淋巴组织在常规病理制片中难度较大[5]，如：切片偏厚，染色对比度差，组织碎裂，细胞固缩，各级试剂难以渗透到组织，固而脱水难度亦较大。为了满足诊断及鉴别诊断的需求，所以对制片的质量就要求更高。笔者认为，影响淋巴结制片质量原因是多方面的，从开始取材到结束制片的每一个环节疏忽，都能导致制片的失败。

经大量阅读相关文献，现已经有很多关于怎么做好淋巴组织切片的经验及体验的文章，但大多是在2015年以前发表的，2015年以后很少有此类的研究，比如：影响淋巴结石蜡制片的因素[6]、提高淋巴结病理切片质量的体会[7]、常规HE染色易出现的问题[8]、淋巴结HE染色中苏木精染色时间的探讨[9]、组织切片常见问题与对策[10-11]、常规石蜡组织切片中的常见问题分析及处理[12]等，郎阔了从取材、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色等过程，都有改进方法，但这些文献都只是针对淋巴组织没有收缩的前提下进行改进的，如果淋巴组织处理不当导致细胞收缩，遇到这种情况，我们常规多采用对该组织重新取材的方法来弥补这一过失。这种方法对有剩余的组织较为适用，但对于已经用完的且较小组织无法重新取材。如果重新取活检，不但给患者带来很大的痛苦，而且延误了病理诊断。针对这一现象，要怎么有效的补救，值得深思。细胞收缩就是细胞的体积缩小，特别是细胞核变小。

在日常工作中，免疫组化的片子和常规HE片子对比，发现经过抗原修复的细胞体积比正常的要大。抗原修复原理如下：甲醛等各种固定液可使蛋白质凝固，引起蛋白质交联而封闭抗原决定簇，阻碍着抗原与抗体结合。断开交联暴露抗原决定簇，使抗原和抗体充分结合，便达到抗原修复的目的。所以免疫组织化学技术的加热抗原修复技术，就是使被封闭的抗原重新暴露，这样使更多的单克隆抗体得以用于检测石蜡包埋组织的抗原表达[13-14]。如淋巴组织中存在着许多不同的抗原，定位在各种细胞的不同部位，同样有膜抗原、浆抗原、核抗原的检测，而淋巴组织病变，主要是看细胞核。热诱导的抗原修复能大大改善组织染色结果，提高抗原的检测率，加热和水解可使甲醛固定时形成交联的蛋白质变性核断开，暴露抗原决定簇[15-16]。但必须根据各种不同部位的抗原而选择适宜的处理时间。目前认为，抗原抗体结合的最适宜PH值为7.4左右[17]。生理盐水是等渗溶液，PH值及渗透压与基体内环境最接近[18]，在这一点上生理盐水更适宜于用作修复介质，并且很少会出现掉片现象[19]。

实际工作中由2名病理主治医师分别阅片，4组淋巴结收缩切片对比阅片结果显示，第1组未经处理的切片，细胞结构不清晰、有收缩、核质颜色对比不明显，切片恢复率0%（0/30）。经过处理的切片镜下细胞变大至约新鲜淋巴组织细胞大小、细胞核的染色质及核仁明显变清晰：第2组生理盐水处理的切片，30张切片均有明显改善，可诊断，切片恢复率100%（30/30）；第3组柠檬酸盐缓冲液，30张切片有20张恢复，可诊断，切片恢复率66.7%（20/30）；第4组EDTA溶液，30张切片有15张恢复，可诊断，切片恢复率50%（15/30）。利用生理盐水当修复液，能使收缩的细胞变大到正常细胞，不会导致细胞过度肿胀，而且经过修复的组织，染色更佳，镜下细胞变大，跟未收缩的细胞体积差不多，细胞核的染色质和核仁更清晰。

本文介绍的方法简单且易行，能有效的改善淋巴组织由于固定不足，引起组织收缩，可应用于临床病理工作当中。

参考文献

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