基于网络药理学的七叶皂苷抑制胶质母细胞瘤的潜在机制

摘要：目的 基于网络药理学技术分析七叶皂苷治疗胶质母细胞瘤（glioblastoma）的药理机制。方法 采用pubchem、 SwissTarget预测七叶皂苷的靶标,采用“GeneCards”、“CTD”和“OMIM”数据库搜索胶质母细胞瘤的靶标。将七叶皂苷和胶质母细胞瘤的靶标进行对比。结果输入STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络，并在Cytoscape 3.8.0软件中制作“药物-靶点-通路”的网络图。采用Rstudio软件进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。利用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)对胶质母细胞瘤和正常人基因表达水平进行深入分析。结果 通过分析一共得到147个七叶皂苷的靶标和1038个胶质母细胞瘤的靶标。七叶皂苷治疗胶质母细胞瘤的交集靶标65个,从其中筛选出 PPI 核心靶标为：STAT3、JUN、MTOR、MMP9、NR3C1、PRKCA，GO富集分析显示1069条生物过程(biological process)、87条细胞组分(cellular component)、54条分子功能(molecular function)，KEGG富集分析显示97条相关信号通路。结论 基于网络药理学分析，七叶皂苷对胶质母细胞瘤的抑制作用具有多靶点、多通路的特点，为进一步研究和药物开发提供了基础。

关键词：七叶皂苷钠；肿瘤；胶质母细胞瘤；网络药理学

中图分类号：R730.23

0 引言

胶质母细胞瘤是最常见、发病率最高、预后最差的原发性的具有高度侵袭性的中枢神经系统肿瘤，占成人原发性脑肿瘤的15%～20%，5年生存率仅为5%[1-2]。胶质母细胞瘤目前的方法包括外科手术治疗，辅助化疗和放疗(Stupp方案)，但是手术难以彻底切除肿瘤，同时重的复发率很高[3]。

七叶皂苷由七叶树干燥成熟的种子即传统中药娑罗子中提取的一类三萜皂苷化合物，在抗炎、抗渗出、消肿、增加静脉张力和抗肿瘤等方面发挥显著作用，且七叶皂苷副作用小，临床已较为广泛的应用于减轻神经损伤、降低炎症反应、促进肠蠕动、抗肿瘤等[4]。研究表明，七叶皂苷钠可以阻断下游AKT、ERK，抑制乳腺癌增殖，并通过抑制SRC的激活诱导乳腺癌细胞的凋亡[5]。七叶皂苷钠可通过抑制JAK-1/STAT-1信号通路抑制胃癌的增殖并诱导凋亡[6]。同时，七叶皂苷钠可以与紫杉醇和FKA形成无聚合物双胞类PTX-a纳米颗粒和FKA-a纳米颗粒。在七叶皂苷钠的帮助下，这两种药物通过被动靶向在肿瘤组织中积累，可显著抑制肿瘤的生长。同时抑制肿瘤细胞P-gp的表达，实现了药物的协同作用并逆转了肿瘤对紫杉醇的耐药[7]。

网络药理学融合了药理学、网络信息学、系统生物学及计算机科学等多种学科，应用于药物与疾病作用靶标的筛选，能够阐明药物发挥的药理作用机制。本研究基于网络药理学方法探究七叶皂苷对胶质母细胞瘤的作用机制，以期为七叶皂苷临床应用于肿瘤治疗方案提供前期的理论依据。

1 方法

1.1 七叶皂苷和胶质母细胞瘤的靶标筛选

在“pubchem”数据库以“Escin”关键词检索,获得七叶皂苷的SDF结构式。然后在SwissTarget网络平台上传七叶皂苷SDF结构式,进行七叶皂苷药物的靶标预测。以“glioblastoma”关键词在GeneCards、CTD和OMIM数据库中检索,获得胶质母细胞瘤的潜在靶标。将结果整合并去除重复的靶标,最终得到胶质母细胞瘤的潜在靶点。

1.2 七叶皂苷和胶质母细胞瘤的交集靶标的获取

将七叶皂苷和胶质母细胞瘤靶标输入至Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic. es/tools/venny/）网站，输出Venn图，获得七叶皂苷钠和胶质母细胞瘤的交集靶标。

1.3 构建PPI网络和药物-靶点-通路网络图

将交集靶标上传至STRING数据库(http://string-db.org)，将筛选物种设置为“Homo Sapiens”，选择参数置信度0.4，去除孤立靶蛋白，构建蛋白质之间的PPI网络。利用 Cytoscape3.8.0软件进行PPI可视化分析,运行CytoNCA插件对交集靶标行拓扑分析，并利用CytoHubba插件根据度(Degree)值排名进行筛选得到其核心靶标。然后运用Cytoscape3.8.0软件将交集靶标构建为“药物-靶点-通路”调控网络。

1.4 富集分析

利用R包“clusterProfiler”进行基因本体功能富集分析(gene ontology，GO)、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，利用 利用R studio选取生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)各自前10个、KEGG富集分析前20个通路分别绘制气泡图。

1.5 预后生存分析

通过Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA)网站对预测的核心靶标在胶质母细胞瘤患者与正常人中进行基因差异表达分析、Kaplan-Meier生存分析、诊断ROC分析。

2 结果 

2.1 七叶皂苷钠及胶质母细胞瘤的靶标获取

结合SwissTarget数据库预测靶标结果共获取七叶皂苷钠潜在药物靶标106个。在GeneCards、CTD和OMIM数据库中检索去除重复靶点然后合并,一共得到胶质母细胞瘤的7571个潜在靶点。七叶皂苷潜在药物靶标靶点和胶质母细胞瘤的潜在靶标合并,得到65个交集靶标,即为七叶皂苷钠治疗胶质母细胞瘤的靶标，结果如图1示。

图1   药物-疾病靶点韦恩图

2.2 核心基因互作分析 

利用STRING平台构建65个交集靶标的PPI网络，并使用Cytoscape3.8.0软件构建可视化网络图(图2)。其中包含65个节点和232条边。节点越大、颜色越深，则表示连接度越高。故最终获得了STAT3、JUN、MTOR、MMP9、NR3C1、PRKCA等6个核心靶标，其中STAT3的连接度最高。

图2   PPI 网络图

2.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 

对65个交集靶标进行GO和KEGG富集分析,一共获得1069条生物过程(BP),87条分子功能(MF),54条细胞组分(CC),在图3展示BP、MF、CC的前10位绘制的气泡图。排名前10位的生物过程主要与钙离子的转运和稳态有关。排名前10位的分子功能主要与蛋白激酶和顺反异构酶的活性有关。排名前10位的细胞组分主要与突触有关。KEGG通路富集分析97条相关信号通路（图4）。65个交集靶标主要富集在炎症介质调节TRP通道、钙信号通路、PD-1检查点通路、HIF-1信号通路，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，NF-κB信号通路，脂肪细胞因子信号通路。这些靶标可能与肿瘤、乙型肝炎、糖尿病心肌病、非洲锥虫病等疾病有关，同时参与多种生化反应进程：神经活性配体-受体相互作用、胰岛素抵抗、化学致癌-受体激活、血管平滑肌收缩、GFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、缝隙连接、FcγR介导的吞噬、Th17细胞分化，内分泌及其他因子调节的钙重吸收。其中，炎症介质调节TRP通道的KEGG通路富集结果如图5所示。

图3   GO富集分析结果

图4   KEGG富集分析结果

图5   炎症介质调节TRP通道的KEGG结果

2.4 构建药物-靶标-通路网络图

在Cytoscape 3.8.0软件中绘制如图6所示药物-靶标-通路网络图，并使用红色、粉色和橙色分别代表药物、靶标和相关通路。 

图6   药物-靶标-通路网络图

2.5 STAT3和JUN的基因相关性分析

基于STAT3和JUN基因在PPI网络中的核心地位，我们利用GEPIA网站分析了STAT3和JUN与胶质瘤的关系。结果表明（图7），STAT3与JUN在胶质瘤均表达增加，且与胶质瘤患者的生存时间呈负相关，提示胶质瘤患者预后后可能与 STAT3和JUN等基因表达水平密切相关。同时诊断ROC结果证明，STAT3与JUN基因具有良好的诊断能力（AUCSTAT3=0.963，AUCJUN=0.858）。

图7   基因相关性分析

3 讨论

胶质母细胞瘤是最常见的原发性脑肿瘤，已被公认为最致命的人类肿瘤之一。它的预后很差，诊断后的生存期不到15个月[8]。经典的治疗标准是外科手术切除后进行同步放化疗[9]。

七叶皂苷类成分是七叶树属植物种子娑罗子中的主要有效成分,已广泛用于七叶皂苷钠冻干粉针等药品制剂的生产[10]。研究表明，七叶皂苷钠能够减小宫颈癌大鼠肿瘤体积,改善胸腺指数、脾指数,可以通过激活PI3K、p-AKT信号通路,调控Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表达,起到降低宫颈癌癌细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡的作用[11]。七叶皂苷钠能够增强肝癌细胞的黏附能力，降低细胞迁移能力，能够降低肝癌扩散转移风险，其对肝癌细胞的抑制作用效果会随着七叶皂苷钠剂量的升高而增强[12]。同时，七叶皂苷通过抑制TXNIP/MLXIPL信号通路，减轻脑水肿，降低氧化应激水平来改善大鼠脑出血模型的神经性损伤水平[13]。

本研究中得到七叶皂苷治疗胶质母细胞瘤潜在靶标共65个,其中包含了STAT3、JUN、MTOR、MMP9、NR3C1、PRKCA等6个核心靶标，这说明七叶皂苷可能通过多靶点治疗的方式治疗胶质母细胞瘤。STAT3是胶质母细胞瘤的主要驱动因子之一，在促进肿瘤生存机制、维持肿瘤干细胞和治疗抵抗等方面发挥着重要作用[14]。STAT3的持续激活可诱导细胞增殖、抗凋亡、胶质瘤干细胞维持、肿瘤侵袭、血管生成和免疫逃逸。这使得STAT3成为有吸引力的治疗靶点和胶质母细胞瘤的预后指标[15]。

根据 GO、KEGG 富集结果,七叶皂苷与钙离子转运和稳态、蛋白激酶和顺反异构酶的活性、突触具有密不可分的关系。KEGG通路富集分析证明，65个交集靶标主要与炎症介质调节TRP通道、钙信号通路、PD-1检查点通路、HIF-1信号通路，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路，NF-κB信号通路，脂肪细胞因子信号通路等信号通路有关。同时65个靶标与多种生化反应进程有关：神经活性配体-受体相互作用、胰岛素抵抗、化学致癌-受体激活、血管平滑肌收缩、GFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗、缝隙连接、FcγR介导的吞噬、Th17细胞分化，内分泌及其他因子调节的钙重吸收等。一项研究结果证实了七叶皂苷与钙离子之间的关系：七叶皂苷可提高线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平，降低细胞内钙离子浓度，与线粒体介导的死亡密切相关[16]。

综上所述，本研究利用网络药理学分析方法， 通过对七叶皂苷抗肿瘤作用的分子机制进行分析，结合TGCA数据库对核心靶标在胶质瘤中的表达和生存预后进行分析。为深入研究七叶皂苷对胶质瘤抑制作用和药物研发提供了理论依据。

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