甲状腺乳头状癌伴钙化标本病理制片满意度的探究

摘要：目的 探讨不同方法脱钙对甲状腺乳头状癌伴钙化组织病理制片满意度的影响。方法 通过苏木素-伊红（HE）染色，观察不同方法脱钙对常规制片的影响；通过免疫组化染色观察组织细胞角蛋白（CK），神经黏附分子（CD56）及甲状腺球蛋白（TG）表达情况，探究免疫组化制片最佳的脱钙方法。结果 5%盐酸甲酸混合脱钙液表面脱钙可取得较满意的结果。结论 5%盐酸甲酸混合脱钙液适合临床推广应用。

关键词：甲状腺乳头状微小癌；钙化；病理制片技术；免疫组化；混合脱钙液

中图分类号：R737.9

Study on the satisfaction of pathological film of papillary thyroid carcinoma with calcification

Zhang Jian   Huang Yichun

Department of Pathology, Ganzhou People's Hospital,Jiangxi Ganzhou 341000

Abstract: Objective To investigate the effect of different methods of decalcification on the degree of satisfaction in the pathological films of papillary thyroid carcinoma with calcification. Methods Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the effect of decalcification on routine preparation. The expressions of keratin (CK), nerve adhesion molecule (CD56) and thyroglobulin (TG) were observed by immunohistochemical staining, and the best decalcification method for immunohistochemical preparation was explored. Results The surface decalcification of 5% hydrochloric formic acid decalcification solution was satisfactory. Conclusion 5% hydrochloric acid mixed decalcification solution is suitable for clinical application.

Key words: papillary thyroid microcarcinoma; Calcification; Pathological film technique; Immunohistochemistry; Mix decalcification solution

甲状腺癌是一种较常见的甲状腺上皮细胞恶性增殖的肿瘤，甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是最常见的甲状腺肿瘤，典型PTC通常含有许多真正的乳头，乳头复杂、分枝状，具有纤维血管轴心，被覆单层或复层立方细胞，间质可水肿、玻璃样变，可含有淋巴细胞、泡沫样巨噬细胞、含铁血黄素。甲状腺乳头状微小癌(papillary thyroid miacrocarcinma, PTMC)为结节最大径线≤1cm的甲状腺乳头状癌，近年PTMC发病率逐增[1-2]。甲状腺癌新发病例中超过50％为PTMC，PTMC是45 岁以上人群最常见的甲状腺恶性肿瘤[3-4]。结节内钙化与肿瘤良恶性有关，50%以上PTMC伴有结节内钙化[5]。取材过程中难以发现微小钙化灶，吴丽娜等[6]已证实表面脱钙在甲状腺组织中具有应用价值，但至今鲜有文献报道哪种表面脱钙能提高制片质量的同时又不影响免疫表达。本文旨在探讨六种表面脱钙对制片满意度的影响，寻找最理想的处理方法。

1 材料和方法

1.1 石蜡标本

收集赣州市人民医院2019.1-2022.12年甲状腺乳头状癌伴钙化组织60例，随机分6组。利用上述六种脱钙液对其脱钙处理，通过HE及免疫组化染色观察不同处理对常规制片和免疫组化CK，CD56及TG表达情况的影响，探究最佳的脱钙方法。

1.2 实验材料

脱钙液的配制：（A）50ml盐酸+50ml甲酸+900ml蒸馏水。（B）50ml盐酸+50ml甲酸+10%中性福尔马林900毫升。（C） 100ml盐酸+900ml蒸馏水。（D）100ml甲酸+900ml蒸馏水。（E）50ml盐酸+10%中性福尔马林950毫升。（F）50ml甲酸+10%中性福尔马林950毫升。

1.3 实验方法及结果判读

组织经常规固定脱水，浸蜡、包埋、切片，HE染色。石蜡常规切4um，使用黏附载玻片，经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化和高温抗原修复处理后，按照试剂使用说明书：滴加3% H2O2覆盖组织25℃，10min，滴加山羊血清覆盖组织样本25℃，30min，组化油笔画圈，滴加即用型一抗，4℃，过夜，二抗覆盖组织，25℃， 60min。 DAB显色，显微镜下观察显色情况，及时终止显色，经苏木素复染，湿封。经两位主治医师双盲判读制片满意情况。根据切片完整性及组织染色清晰度评分，两项指标乘积≥5 分为非常满意，≥3分为满意，＜3分为不满意[7-9]。

2 结果

A与B脱钙液处理优于其他脱钙方式，差异具有统计学意义（P＜0.05）。A与B 脱钙液处理均能取满意的效果，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组染色满意情况具体如表1所示。

表1   不同脱钙液处理后制片满意（例数）情况

A和B两种脱钙液对组织HE染色及免疫组织化学染色均获得满意的制片效果，常规HE染色，免疫组化CK，CD56及TG染色情况如图1所示。

图1   HE及免疫组化法染色结果

注：a. HE 染色   b. CK染色   c. CD56染色   d. TG染色

3 讨论

病理诊断是医学诊断的金标准，诊断精确就必须有高质量的制片[10]。骨组织是黏多糖和纤维蛋白及沉着于其中的无机盐，是一种坚硬的结缔组织 [11-12]。脱钙是钙化组织制片技术的关键步骤[13]。钙化组织是一种坚硬的结缔组织，与其他结缔组织基本相似，也是由细胞、纤维和基质构成的。但钙化的最大特点是细胞基质具有大量的钙盐沉积，成为很坚硬的组织。由于钙化组织里有钙盐，影响常规石蜡切片制作，因此钙化病灶固定后，需先将钙盐除去使组织软化，才能进行常规切片。若脱钙不充分，则切片易碎裂，并损伤切片及刀刃，脱去钙盐的过程即脱钙。一些强酸如盐酸，硝酸等能快速有效除去骨组织中钙盐，但对组织抗原蛋白会造成致命性破坏[14]，本实验通过效仿股骨头二次表面脱钙法，探究甲状腺乳头状癌伴钙化标本制片方法，取得比较满意的效果。

随着医学技术的不断提高，高分辨率超声筛查技术在体检中广泛应用[15-16]，甲状腺乳头状癌患者检出率也逐年提高。甲状腺乳头状癌是最常见的甲状腺肿瘤，通常情况下预后良好。复发、转移和死亡仅发生在少数患者中，并且更常见于更具侵袭性的肿瘤，如高细胞，柱状细胞或甲状腺乳头状癌的弥漫硬化亚型。90%的儿童甲状腺恶性肿瘤是PTC，PTC无明显临床症状，通常表现为体检时发现的甲状腺无痛性肿块，PTC很少影响甲状腺功能，故甲状腺功能实验对PTC的诊断没有帮助，但PTC的超声诊断具有显著特异性，结节内钙化斑点对于超声诊断具有显著临床意义[17]。PTC原发肿瘤大小不一，从镜下所见到几厘米，常见多中心性生长，许多肿瘤会出现囊性变。PTC显示不同的大体形态，大多数肿瘤表现为切面实性略呈白色、质稍硬，界不清，部分病例会出现沙砾体和钙化，切面可有沙砾感，影响切片质量。有研究表明钙化尤其是微钙化对提示甲状腺乳头状癌有一定的指导意义，而钙化的发生与肿瘤大小成正比，肿瘤越大，发生钙化的可能性越高[18]。

细胞角蛋白（CK）作为一种中间丝，存在于所有上皮细胞及部分非上皮细胞，几乎所有肿瘤类型都有细胞角蛋白的表达[19]。甲状腺球蛋白（TG）是由甲状腺滤泡上皮细胞合成的一种高分子量糖蛋白，是甲状腺激素合成和储存的载体。甲状腺转录因子-1（TTF-1）在胚胎发育过程中首先表达于喉气管憩室的发生阶段，并定位于支气管上皮。支气管树发育形成后，其表达转移至外周气道上皮，甲状腺特异性基因的表达也需要TTF-1。神经细胞黏附分子（CD56）是一种膜糖蛋白，是一种同类亲和性的吸附蛋白，表达于正常甲状腺滤泡上皮，甲状腺上皮癌变后失黏附，CD56阴性表达。CK、Tg和TTF-1一般呈阳性表达，而CD56、Syn和CgA呈阴性表达[20]。本实验选择甲状腺乳头状癌阳性表达的CK、TG和阴性表达的CD56作为免疫组化观察项目。

单纯酸的脱钙液以往曾广泛应用于病理组织脱钙，但由于酸类易引起组织损伤、抗原丢失致使骨胶原及细胞核染色效果不佳。甲酸脱钙的速度较缓慢[12]，盐酸是一种无机酸性质的强酸，具有较强的挥发性，能与钙化组织中的钙盐结合加速脱钙，对组织收缩小，脱钙均匀完整，能较好保存骨及钙化组织中的组织和细胞结构，且低浓度盐酸能较好的保持骨组织和钙化组织的抗原性 ，是骨及钙化组织进行免疫组化染色良好的脱钙液。甲酸脱钙缓慢，影响制片速度，为减少甲酸脱钙速率缓慢并对组织产生膨胀的不足，加入适量盐酸，盐酸对组织不膨胀，有少量的收缩作用[21-22]，所以这两种酸混合使用，既加快脱钙速度，同时又防止纤维组织过度膨胀，减少组织破坏及对染色的影响。本实验A 与B两种脱钙液在对甲状腺乳头状癌伴钙化脱钙时间掌握及制片满意度方面均优于其他脱钙液，结果与学者研究结果一致[23-24]。因A 较B配制更简单，所需试剂更环保，所推荐临床使用A脱钙液。

甲状腺乳头状癌涉及MARPK通路效应物的特异性突变或基因重排在其恶性转化过程中起关键作用，多数病例可以检测到RET、NTPK、BRAR或RAS的特异性、非重叠激活事件[25]。其中，BRAF突变是甲状腺乳头状癌最常见的遗传学事件，其位于染色体7q24，编码丝氨酸/苏氨酸激酶，通过RAS/RAF/MEK/ERK级联络通路传导调控信号，获得BRAF突变的另一条通路，使ERK信号异常激活，甲状腺乳头状癌最常见的分子遗传改变是BRAF V600E[26-27]。由于标本数量及经费有限的局限性，脱钙处理方法对分子检测结果影响本次实验未作统计分析，实验结果具有有限的临床指导意义，后期我们会加做对分子遗传检测影响的分析，以求实验结果具有更大的临床指导意义。

值得注意的是：①表面脱钙前需粗切暴露出所需切面②所需切面朝向脱钙液③脱钙后流水冲洗10min以上④表面脱钙后尽量少粗切，大约10um厚就可细切⑤脱钙时间取决于钙化程度及室温等因素⑥4um厚度粘附性载玻片更利于实验操作⑦未固定好的标本易受酸的损害，因此组织固定一定要充分。

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基金项目:赣州市指导性科技计划项目(GZ2020ZSF182);青年人才扶持项目(QNRC2018005)。