3919例B族链球菌检测结果分析

摘要：目的 了解妊娠晚期 (孕34～37周) 女性生殖道中B族链球菌(GBS)的带菌情况，评估其对母儿预后的影响。方法 选取2021年5月至2023年5月于我院产科门诊就诊的孕晚期(孕34～37周) 孕妇，取孕妇阴道或肛门分泌物送检，通过对分泌物进行提取，使用实时荧光定量聚合酶链反应方法检测是否存在GBS-DNA，并对检测的结果进行分析。结果 孕晚期妇女GBS带菌检出率为5.21% (204/3919)，且对所检测的孕妇进行追踪随访，对GBS阳性的孕妇进行干预，其在产后未出现孕妇及胎儿感染的情况。结论 实时荧光定量聚合酶链反应是一种快速准确筛查孕晚期GBS感染的方法；妊娠晚期孕妇GBS感染可能会导致胎膜早破、早产、宫内感染、胎儿窘迫和新生儿感染的发生率升高，及时采取干预措施可有效降低不良妊娠结局，应加强对广大孕晚期孕妇的宣传，积极进行GBS筛查，做到早预防与治疗，减少新生儿早发GBS感染的发生，为母婴健康保驾护航。

关键词：B族链球菌；孕晚期；实时荧光定量聚合酶链反应

中图分类号：R714.15

链球菌（Streptococcus）是一种常见的化脓性球菌，隶属于芽孢杆菌纲、乳杆菌目、链球菌科。其大小为0.6-1.0微米，球形或椭圆，多为链状排列，短有的4-8个，长的为20-30个组成。无芽胞，无鞭毛，革兰氏染色呈阳性的菌毛状，含有M型蛋白质。而B族链球菌（group B Streptococcus,GBS）又被叫做无乳链球菌，它属于一种革兰阳性的溶血链球菌，能够导致各种疾病[1]。B族链球菌（GBS）感染主要发生于成人妇女的阴道部及直肠部，在我国人口中的比例约占15%-35%。B族链球菌能向尿路转移，且经常伴有假丝酵母菌的存在。不同种族、不同地区和不同年龄的女性携带率存在差异，拥有多个性伙伴关系的女性携带率高，孕妇、新生儿和糖尿病患者的携带率也高。一般分有三种带菌型：一过性、间歇性和慢性带菌[2]。通常情况下，健康女性在感染GBS后并不发病。但如遇到机体的免疫力低下或受到其它因素的干扰，那么B链球菌将会进行大量繁殖。GBS对绒毛膜的吸附与穿透力较强，它能导致泌尿系统感染、羊膜绒毛膜炎、产褥感染、孕产妇败血症等。新生儿早产，胎膜早破，新生儿败血症等与B链球菌有关[3]。 GBS在新生儿中主要为垂直传播，由母亲传给胎儿，与出生的类型无明显关系；剖腹产并不能完全防止胎儿发生GBS感染。新生儿GBS感染的临床表现由肺炎，败血症，脑膜炎，以及严重的呼吸道疾病。即使是幸存下来的婴儿，也会有脑积水、智力障碍、小头畸形、耳聋等严重的神经系统后遗症[4]。此外，该细菌还会导致孕妇发生感染，导致早产、胎儿发育不良、胎膜早破以及后期流产等。所以，在妊娠后期进行GBS携带者的筛查，并针对携带者进行针对性的防治，对于减少围产期新生儿的GBS感染率至关重要。通过对该地区妊娠后期人群中GBS的携带率进行动态监测，以便指导及预防新生儿GBS感染。

1 材料和方法

1.1 标本来源

2021年5月至2023年5月在医院产科门诊就诊的妊娠34～37周的孕妇；年龄14～48岁，共采集分泌物标本3919例。（纳入标准：所有孕妇的孕周经过核对确认无误、1个月内未使用抗菌药物。排除标准:孕妇本身存在阴道炎症或其他细菌感染的情况、习惯性流产、合并严重的脏器功能障碍或妊娠期合并症、胎儿存在明显先天的缺陷、伴有免疫功能缺陷）。

1.2 仪器与试剂

荧光定量PCR仪为西安天隆科技有限公司生产的TL988型PCR荧光扩增仪，所用检测试剂盒为北京博尔诚技术有限责任公司生产的B族链球菌检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。用特异性的引物及探针对样本进行了DNA分析，以确定是否有GBS的存在。本试剂盒所采用的UNG酶系，可有效地防止因放大污染而引起的假阳性[1]。

1.3 方法

（1）样本采集：采样容器均为一次性无菌采样拭子。

1）怀孕34-37周的妇女生殖道样本采集方法：首先用棉花棒擦拭掉阴道口多余的分泌物，然后将灭菌拭子从阴道到内侧1/3，沿着阴道壁轻轻地转动取出排出的分泌物，把收集到的拭子放进一个无菌试管里;

2）怀孕34至37周妇女的直肠分泌物采集方法：在肛门括约肌的旁边，无菌拭子在肠壁上轻轻地转动，以获取分泌物，把收集到分泌物的拭子放进无菌管里；

样本采集后做好标识，及时放入样本转运箱，尽快送达实验室。样本如不能及时检测，则在2-8℃条件下保存不应超过24小时；在-18℃以下的条件保存不超过4天。

注：含血的样本无法正常检测（可能会抑制扩增反应），临床上常见的“保妇康栓”栓剂药物对测定结果有很大的影响，在采样之前要尽量避开这类药物。

（2）标本处理及提取DNA: 在含有分泌物的取样管中加入约1ml的无菌生理盐水，经充分震荡混匀，把无菌拭子贴着管壁，轻轻捻压，把里面的液体尽可能地挤出，然后将其丢掉，再把里面剩下的标本液体转移到1.5ml的离心管中，12000rpm离心10分钟后，然后把上清丢掉，再在离心管中加入1ml的无菌生理盐水，在震荡和混匀之后，再次离心弃掉上清，往离心管里的沉淀中加入50μL的提取液，震荡充分混匀，将离心管盖紧管盖，放在100℃的干浴锅上加热煮沸10min，12000rpm离心10分钟后，把上清吸取到1.5mL离心管中保存起来备用。(注：在DNA提取完成后，为确保实验结果的准确性，应尽快进行PCR检测)

（3）准备 PCR反应溶液：将试剂盒从冰柜中取出，在室温下平衡，将PCR反应溶液混合均匀后瞬时离心。按照每管35μL的体积，将反应液分装到反应管中，待用；按照样品和质量控制孔的数目，将已经分好反应液的同样数目的反应管转移到样品处理区。

（4）加样：在已分装好反应液的各反应管中，分别加入已处理好的DNA样品5μL、空白对照、及阳性

对照品各5μL，将管盖盖上，进行瞬间离心，让所有试剂及样品集中到反应管底部，再将其转移至扩增区。

（5）扩增：按照说明书，在扩增仪上设定了以下条件：UNG反应：50℃ 2min，预变性95℃ 5 min,(95℃15 s,60℃35 s)45个循环。（在60℃时，分别检测 FAM和 HEX （VIC）通道的荧光信号，选择40uL的反应体系）

（6）质量控制：

1) FAM通道的测定：a）无 Ct值；b) GBS阳性对照：Ct≤30.00；

2) HEX通道的测定：参考值 Ct≤35.00；上述条件必须在同一试验中得到满足，即可说明质控在控。

（7）检测结果分析和判定：扩增结束后手动设定阈值，根据扩增曲线进行结果的判读。

1)判断阴性结果：当FAM通道没有出现Ct值，而HEX通道信号正常时（Ct≤35.00)，此样本为阴性；

2)判断阳性结果：a）当样本的FAM通道Ct≤38.00时，判断样本为阳性；b)如果一个试样的38.00< Ct≤45.00，那么建议对这个样本重新检测，如果再次检测的结果仍然是38.00<Ct≤45.00，或者Ct≤38.00，那么判断为阳性；在未出现Ct而HEX通道信号正常的情况下（Ct≤35.00)，判断为阴性；

注意： HEX通道为一个内部参考信号，用它来检测PCR系统中是否存在干扰因子，或是否由于PCR系统的劣化所引起的假阴性反应。如内部参考品的HEX通道Ct值的缺失则提示PCR反应受到了抑制，从而导致了扩增失败。

1.4 应用 SPSS19.0对数据进行处理

对不同年龄组别的样本量进行了χ2检验。当P<0.05时，两组比较有显著性差异。

2 结果

从3919名妊娠后期（34-37周）女性分泌物样品中发现204名GBS携带者，总的阳性率为5.21% 。其中≤19岁年龄组的阳性率为1.92%；20～25岁组别的阳性率为4.93%；26～31岁组别的阳性率为5.33%；32～37岁组别的阳性率为5.53%；38～48岁组别的阳性率为5.48%。通过对不同年龄组孕晚期(34～37周)妇女GBS携带率的比较，发现32～37岁带菌检出率最高(5.53%，52/940)，与其他年龄组比较，差异没有有明显统计学意义(P>0.05),具体的阳性率详见表1。

表1   不同年龄组孕晚期 GBS 检出率情况

3 讨论

本研究中2021年5月至2023年5月共检测孕晚期孕妇分泌物样本3919例，其中有204例样本GBS检测阳性，总的GBS带菌率5.21%（204/3919）。带菌率远低于国内文献报道我国孕妇的GBS阳10%-30%[5-7],也低于广东江门等地区15.3%［8-9］。

因本研究的样本数量不够庞大，以上带菌率不能代表本地区晚育期孕妇携带B族链球菌的情况，带菌率同时可能跟该地域、生活习惯或民族等因素的差异有关[8]。在不同年龄组的孕晚期孕妇GBS带菌检出率存在差异，其中年龄≥19岁孕晚期妇女的检出率为1.92%（2/104），这可能与年轻机体的抵抗力或感染后自我修复能力有关；但是，在32-37岁孕晚期孕妇组中，检出率是最高的（5.53%,52/940)，这可能是因为在这个时间段内，女性的性生活的活跃程度、妊娠期的激素水平等因素造成了生殖道的微环境发生了变化[10-11]。

B族链球菌能导致奶牛的乳房炎，严重影响养殖业的健康发展，早期已成为畜牧、兽医学研究的热点。1938年Fry曾报告三例由B型链球菌引起的分娩后心脏内膜炎病例，证实B型链球菌为人类最普遍的致病细菌之一。B型链球菌是女性的一种比较普遍的细菌，通常不会引起女性的健康问题。在B族链球菌存在于体内的时候，由于机体的免疫力降低及其它因素的干扰，会引起B族链球菌的大规模繁殖，从而影响到身体的健康。B族链球菌是引起妇女生殖系统疾病的重要致病细菌，对妇女及新生儿的生命安全造成了极大的威胁。早产、胎膜早破、胎儿宫内窘迫、产褥感染等都是妊娠晚期感染生殖道 B族链球菌引起的[12-13]。

B族链球菌细菌可在生殖道分泌大量前列腺素及细胞因子，使妊娠妇女出现宫腔萎缩，导致胎膜早破，导致新生儿早产。B族链球菌由于其极具穿透性，一旦进入到胎盘，就会引起胎儿的子宫内膜发生炎症反应。它可以引起子宫内感染，也有一定的几率会导致胎儿出现宫内窘迫的情况。其中，胎儿困窘是影响母亲进行剖腹手术的主要原因。

导致分娩性感染最常见的致病细菌为B族链球菌。在国内，孕妇在产褥期发生感染的几率在1%-7.2%之间。其中，分娩期间发生的感染是最主要的原因之一。根据有关资料显示，从产热病人的血样中分离到的病原菌中GBS含量约为11%-21%。GBS是导致分娩后期宫腔炎症及母体发生脓毒症的主要原因，其发生率为千分之一点三和千分之二。跟GBS感染相关的子宫内膜炎症、宫旁组织炎症的发生率大概是1%；在这里面有三分之一是GBS单独感染的，三分之二的比例是GBS和别的细菌共存；还有约三分之一患者发生了菌血症，这些菌血症中有94%的病例是与剖宫产密切相关。产褥期感染的主要临床特征是早期会出现发烧，一般是在分娩后的11个小时内出现。病人有畏寒，心率快，腹胀，子宫复旧不良，子宫旁边或附件有触痛的症状。如果体内温度超过38℃，一般常伴有细菌血症的存在。在感染初期，由于使用了高效的抗菌药物，GBS的感染得到了控制，但是合并脑膜炎，心内膜炎等并发症的存在也时有发生[14-17]。

近年来B族链球菌在围产医学中处于不可忽视的地位，它早已被证实为围产期母婴感染、新生儿败血症、脑膜炎的主要致病菌之一。。GBS阳性的带菌孕妇易发生胎儿发育不良、胎膜早破、早产、流产等情况；同时也可可能引起胎盘的慢性感染以及绒毛膜羊膜炎、子宫内膜炎、败血症等泌尿生殖道感染、化脓性关节炎等[18]。

新生儿B族链球菌的感染分为两种，一种是早发型，一种是晚发型。早发型感染主要发生在分娩后的6-12个小时内，而足月的婴儿一般在24个小时之后才会出现。轻度的菌血症没有明显的临床表现，重度的菌血症则会出现肺炎，败血症和脑膜炎。严重的子宫感染会导致新生儿窒息，昏迷，甚至休克，通常伴有呼吸系统疾病和持续性的肺血管压力高。会出现青紫、呼吸暂停、呼吸急促、鼻扇、三凹征等呼吸道表现，在胸部可以看到网状颗粒影、肺斑点浸润，很难看到胸膜渗出、肺水肿、心脏增大和肺血增多的情况。如果有脑膜受累，可能会出现惊厥、嗜睡、昏迷、拒奶、前囟凸等症状，如果怀疑有早发或迟发的新生儿脓毒症，都需要进行脑脊液检测。晚发性感染以脑膜炎、脓毒症及局灶性病变为主。症状包括发烧，昏迷，呕吐和抽搐。还可能与骨髓炎、关节炎、蜂窝织炎、尿路感染等疾病有关[19-20]。

美国CDC于2010年公布的《围生期B族链球菌防治指南》明确规定妊娠35-37周为B族链球菌筛查的适宜时机。目前怀孕期间有GBS菌尿、最近一次新生儿GBS感染史、怀孕37周以前分娩、羊膜破裂18小时、分娩体温超过38.0℃者、更需做GBS检查[21]。

B族链球菌感染判定的金标准是细菌培养，但细菌培养所需要的时间较长，且培养阳性率受多种因素的影响，培养法检出率不高，从而导致细菌培养方法学没有被推广应用于实际的临床工作。B族链球菌的血清学检测具有检测速度快的特点，但该方法学特异性不高，故而在临床的应用推广也受限制。而PCR技术因操作简便、快速准确等优点，目前已广泛被应用于感染性疾病的快速辅助诊断方面。

总之，GBS是一种普遍存在的病原菌，可对妊娠妇女和胎儿造成极大的危害。考虑到B族链球菌对母体和胎儿的危害，因此，对孕期B族链球菌（GBS）的高危人群，必须开展GBS的早期诊断和干预。在怀孕后期感染B族链球菌感染的人群，若不及时进行有效的处理，那么出现胎膜早破，早产，产褥期感染，新生儿感染的几率将会显著增加[22-23]。美国疾病控制中心在《围产期GBS预防指南》中提出，对于B族链球菌呈阳性的妊娠妇女应进行预防性干预，而青霉素长期被认为是GBS防治的第一选择药物，目前临床上最常采用的给药方案是500万（IU)进行静脉注射(IV)，随后的4个小时内再给250-300万（IU)静脉注射(IV)，直至胎儿分娩。氨苄青霉素也是一种不错的选择药物，第一次服用的剂量为2g，之后4-6小时服用1g，直到生产结束。如果使用头孢唑啉，那么第一次给药2克，然后8小时给1g，直到生产。B族链球菌（GBS）感染后，多数细菌对克林霉素和红霉素产生耐药。一些菌株易于产生克林霉素的抗药性；但是，有些菌株对红霉素有较强的抵抗性，它可能会诱发克林霉素的不敏感性。若对克林霉素或红霉素无反应，则可选择1g的万古霉素，12个小时内给予1g，直到生产结束。对青霉素过敏的高风险孕晚期妇女应进行清楚备注，避免使用以免发生不良反应。造成 GBS感染的菌株分型较少，因此，有目标性地研发及使用疫苗，不但可以降低GBS的发病率，而且可以降低对GBS的抗生素用量，降低GBS的耐药性。研究表明，对妊娠32-34周的孕妇进行特异性的GBS免疫可有效防止婴儿和产妇发生产后GBS感染。而对于B族链球菌感染的女性来说，在怀孕后期，可以通过使用抗菌素进行有效的处理，从而降低怀孕的并发症；增加顺产率，减少感染率，显著改善怀孕结果；可有效避免新生儿早发GBS感染可能给母婴带来的严重后果[24-26]。

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基金项目：课题来源：广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题，课题名称《ABCB1 基因多态性对利伐沙班临床用药效果影响的机制研究》,合同编号:Z-A20221185。