基于生物信息学的特发性肺纤维化关键基因及miRNA分析

摘要：目的 基于生物信息学的方法分析特发性肺纤维化（IPF）患者与正常人的基因芯片数据，找到差异表达基因，通过蛋白质互作网络找到关键基因，通过基因调控网络寻找潜在miRNA。方法 首先从Gene Expression Omnibusl( GEO) 数据库下载２个基因芯片数据集：GSE5384和GSE24206，通过R语言分析得到差异表达基因，并进行GO 、KEGG通路分析，使用STRING及Cytoscape软件进行蛋白质－蛋白质相互作用网络分析(PPI)，从而得出核心基因，最后通过NetworkAnalyst网络构建寻找潜在miRNA。结果 筛选出137个差异表达基因。GO分析显示这些差异基因主要与细胞外基质、胶原组织以及免疫炎症等生物学功能相关，KEGG通路分析与蛋白代谢、ECM-受体、细胞黏附等通路密切关联。PPI网络CytoHubba分析出10个核心基因，包含：COL3A1、COL1A2、POSTN、COL5A2、THBS2、COL14A1、COL15A1、MXRA5、TGFB3及ASPN。通过构建基因-miRNA相互作用网络筛选出hsa-mir-29b-3p、hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-29c-3p、hsa-mir-26b-5p、hsa-mir-335-5P等5个miRNA。结论 通过生物信息学对IPF的研究，分析出差异基因、核心基因及miRNA，在一定程度上阐明了特发性肺纤维化疾病发生发展过程中的分子调控机制，为寻找治疗提供新思路。

关键词：特发性肺纤维化；生物信息学；差异基因；核心基因；miRNA

中图分类号：R563

特发性肺间质纤维化（idiopachthic pulmonary fibrosis，IPF）目前病因不明确，病情进展，临床上以刺激性干咳、进行性呼吸困难等为主[1]，预后差。一旦确诊中位生存期仅3-5年，5年生存率不在20%[2]。目前西药治疗多以口服激素以及对症治疗为主，而抗纤维化药物例如吡非尼酮、尼达尼布等虽有一定疗效，但临床上应用仍有争议，且价格昂贵，限制其广泛应用。目前越来越多的人探究特发性肺间质纤维化的发病机制，目的寻找新的治疗靶点。本文基于生物信息学方法研究特发性肺间质纤维化，寻找IPF差异基因，探讨其发病分子机制，找寻其治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 数据下载

从 GEO 数据库（GEO，http：// www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）［3］下载2个基因芯片数据集：GSE21369［4］、 GSE53845［5］。GES21369包含有6个正常标本组织及11个疾病标本组织，GES53845包含有8个正常标本组织及40个疾病标本组织。

1.2 差异表达基因

下载的数据集经过背景校正、标准化、归一化等预处理，利用注释文件对探针进行注释，及清洗数据。利用R语言中limma包［6］进行两组数据差异性分析，筛选出差异表达基因（differentially expressed gene，DEG），DEG 的筛选条件为 P.Val＜0.05 和 |logFC|＞1。

1.3 差异表达基因的GO分析、KEGG通路分析

基因本体数据库（gene ontology,GO）通过分子功能（molecular function,MF）、生物过程（biological process，BP）和细胞组成（cellular component,CC）的注释，为差异基因提供多方面的功能注释。而京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）一个信号通路数据库，探索疾病发病机制中关键的信号通路进行注释。通过两者应用揭示差异基因在细胞水平的功能特征，其在生物过程中的作用。理解差异基因与疾病之间的关联。方法使用R语言clusterProfiler包GO分析、KEGG通路分析 [7]。P＜0.05有统计学意义。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及关键基因的筛选

STRING数据库是一个搜索已知蛋白质和预测蛋白质之间相互作用数据库，通过研究蛋白相互作用网络，挖掘其核心调控基因。目前该数据库是相互作用最大的一个。通过 STRING数据库[8]（search tool for the retrieval of interacting genes,STRING） (http：// www. string-db.org/）分析蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interacting,PPI）网络分析。该在线工具揭示蛋白质之间潜在相互作用，我们设置条件阈值：中度可信0.4。为进一步筛选出PPI网络中的关键基因，我们使用Cytoscape软件中MCODE插件。MCODE插件通过寻找PPI网络中Hub基因，相互作用网络中连接较高节点，发现潜在调控点。

1.5 关键基因miRNA预测

使用NetworkAnalyst 3.0（https://www.networkanalyst.ca/）是一个可视化的在线平台，实现基因调控网络可视化，深入挖掘miRNA与关键基因的相互作用，提供有力支持。miRNA使用数据库：miRTarBase数据库（http：//mirtarbase.cunk.edu.cn/php），为预测与关键基因相关的miRNA提供了准确预测能力。

2 结果

2.1 差异表达基因结果

基于GSE21369和GSE53845的原始数据，以log2FC＞1或者log2FC＜-1和 P ＜ 0. 05 为 筛选标准，共得出 137个差异表达基因，其中93 个上调基因，44个下调基因，见图1。将所得结果分别绘制成火山图和韦恩图，图中黑点代表无差异基因，蓝色代表下调基因，红色代表上调基因。灰色部分代表两个数据集的交集部分。

图1   差异表达基因的火山图、韦恩图

2.2 差异表达基因的GO分析、KEGG通路分析

137个差异表达基因进行GO分析、KEGG通路分析。GO分析结果显示：IPF主要与细胞外基质、细胞外结构、胶原纤维组织、胶原蛋白、内质网、基底膜、硫化合物、肝素、整合素、生长因子、细胞黏附因子、天冬氨酸等相关。KEGG通路分析结果显示：蛋白消化吸收途径、ECM-受体相互作用、细胞黏附通路等均与IPF有密切关联。结果见图2。

图2   差异表达基因的GO分析、KEGG通路分析

2.3 差异表达基因的蛋白互作网络图

差异表达基因通过STRING数据库构建PPI网络，其中核心基因的10个基因使用Cytoscape v. 3.7.1确定中CytoHubba插件确定，这些基因是：COL3A1、COL1A2、POSTN、

COL5A2、THBS2、COL14A1、COL15A1、MXRA5、TGFB3及ASPN，结果见图3。

图3   核心基因

2.4 关键基因miRNA相互作用网络 

10个关键基因使用NetworkAnalyst在线分析构建基因-miRNA相互作用网络，结果显示 hsa-mir-29b-3p同时参与调节COL3A1、COL5A2、COL15A1、TGFB3、THBS2；hsa-mir-29a-3p同时参与调节COL3A1、COL5A2、COL15A1、TGFB3；hsa-mir-29c-3p同时参与调节COL3A1、COL5A2、COL15A1、COL1A2；hsa-mir-26b-5p同时参与调节、ASPN、COL1A2、COL15A1；hsa-mir-335-5P同时参与调节ASPN、COL3A1、COL15A1。

3 讨论

通过对GSE21369和GSE53845数据集的深入分析，我们成功挖掘出与特发性肺间质纤维化（IPF）相关的137个差异表达基因。通过GO分析、KEGG通路分析，这些差异基因不仅在生物学功能上主要与细胞外基质、胶原组织以及免疫炎症等密切相关，同时在蛋白代谢、ECM-受体、细胞黏附等通路中发挥着重要调控作用，涉及到多个方面揭示了复杂的分子调控网络。进一步通过PPI网络CytoHubba的分析找出10个核心基因，它们是COL3A1、COL1A2、POSTN、COL5A2、THBS2、COL14A1、COL15A1、MXRA5、TGFB3及ASPN。这些核心基因在IPF的发病机制中可能扮演着关键的角色，通过它们之间的相互作用，我们有望更全面地理解IPF的病理生理过程。更进一步的研究中，在基因水平研究上，我们通过构建基因-miRNA相互作用网络，筛选出与IPF相关的5个miRNA，包括hsa-mir-29b-3p、hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-29c-3p、hsa-mir-26b-5p、hsa-mir-335-5P。在这个网络中，hsa-mir-29家族凸显出其在IPF发病机制中的主导作用，成为我们研究的一个焦点。

近年来，miRNA与呼吸系统疾病之间的关系受到越来越多的学者关注。miRNA是一种非编码的单链小分子RNA，通过碱基互补配对的方式与mRNA结合，在转录后调控蛋白的表达。研究发现，同一种 microRNA可以调控多种mRNA的表达，而同种mRNA也可能受到不同miRNA的调控［9-10］。这一发现为我们提供了更深入了解miRNA在IPF中作用机制的机会。关于hsa-mir-29家族的研究中发现，mir-29家族由 mir-29a、mir-29b、mir-29c 三种成员构成，这三种成员之间仅存2-3个核苷酸位点的差异，因此它们作用的靶基因也往往相同，具有高度的保守性［11］。当前有相关文献报道hsa-mir-29家族通过不同方式抗纤维化。陆小威等[12]研究表明hsa-mir-29可通过抑制TGF-β1 /Smad3 信号通路，从而达到抗纤维化的作用。孙一波等[13]研究发现miRNA-29b对肺纤维化上皮-间质转化的调控而起到抗纤维化作用。童佳欢等[14]发现黄芪甲苷对博来霉素肺纤维化模型小鼠中的治疗作用进行分析，发现机制可能与miR-29b等相关分子相关。路尧等[15]也有相关报道。这些发现揭示了miRNA在IPF治疗中的潜在机制，为未来的药物研发提供了有力的支持。

综上所述，通过对两个数据集进行差异性分析，我们成功找到了关键基因，并筛选出与特发性肺间质纤维化相关的潜在miRNA，如hsa-mir-29b-3p、hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-29c-3p、hsa-mir-26b-5p、hsa-mir-335-5P等。这一研究为特发性肺间质纤维化的发病机制提供了理论依据，同时为治疗该病寻找新的靶点提供了有力支持。这项研究采用了数据集和生物信息学方法，全面解析了IPF的发病机制，为临床医生提供更好的治疗方案，为相关领域的学者提供了新的研究思路。我们相信，这一研究将为特发性肺间质纤维化的治疗和预防提供有力的支持，为患者带来福音。

参考文献

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基金项目：甘肃省自然科学基金项目（No.20JR5RA165）。