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基于网络药理学和分子对接探究小柴胡汤治疗肝癌的作用机制发表时间:2024-10-29 12:35来源:湖北中医药大学附属新华医院 摘要:目的 探究小柴胡汤治疗肝癌的作用机制。方法 根据网络药理学对小柴胡汤关键活性化合物以及肝癌核心靶点进行处理分析,绘制其化合物-靶点网络图;根据二者的交集靶点进行PPI网络图分析;对交集靶点进行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。筛选出关键配体和受体进行分子对接。结果 筛选出小柴胡汤中共207个活性化合物,对应肝癌239个靶点,通过数据分析得出,小柴胡汤治疗肝癌的核心有效活性成分有山奈酚、荜澄茄素、黄芩苷等,其治疗肝癌的核心靶点有AKR1B1、MMP2、ESR2等;其生物过程主要参与的反应有蛋白质磷酸化、细胞生长的正向调节和信号转导以及RNA聚合酶II启动子转录等;细胞的组成部分包括细胞核、细胞质、质膜和核质等;分子功能富集的反应主要包括蛋白丝氨酸/酪氨酸/苏氨酸激酶活性、ATP结合、蛋白结合等;KEGG分析结果显示主要信号通路包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、MicroRNA在癌症中的作用等。结论 小柴胡汤所含的主要活性化合物具有调节机体免疫反应或应激的作用。通过关键靶点做出反应,可能有助于肝癌的预防和预防, 可达到治疗效果。它是多成分、多靶点、多途径相互作用的结果。 关键词:小柴胡汤;肝癌;网络药理学;分子对接 中图分类号:R735.7 Mechanisom of Xiaochaihu Decoction on Liver Cancer Based on Network Pharmacology Methods and Molecular Docking DING Lingling Xinhua Hospital Affiliated to Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan Hubei 430000 Abstract:Objective: To explore the mechanism of Xiaochaihu Decoction in treating liver cancer. Methods: Based on network pharmacology, Venn diagram analysis, compound-target network diagram and PPI network diagram analysis were conducted on the key active compounds of Xiaochaihu Decoction and the core targets of liver cancer. Analysis of the GO function enrichment analysis of the intersection target and the KEGG pathway enrichment analysis. Screening key ligands and receptors for molecular docking. Results: A total of 207 active compounds in Xiaochaihu Decoction were screened out, corresponding to 239 targets of liver cancer. Through data analysis, it was concluded that the core active ingredients of Xiaochaihu Decoction in treating liver cancer include Kaempferol, Cubebin, Baicalin, etc. Among them, The core targets for the treatment of liver cancer include AKR1B1, MMP2, ESR2, etc.; the biological processes involved include positive regulation of RNA polymerase II promoter transcription, protein phosphorylation, positive regulation of cell proliferation and signal transduction, etc.; cells The components include nucleus, cytoplasm, membrane, and nuclear quality; molecular functions mainly include proteinline/soure/tyrosine kinase activity, ATP binding, protein binding, and the same protein binding; MAPK signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, MicroRNA in cancer, the role of proteoglycans in cancer, etc. Conclusion: The key active compounds in Xiaochaihu Decoction can regulate the body’s immune response or stress response through core targets to achieve the effect of preventing and treating liver cancer. It is the result of the interaction of multiple components, multi-targets, and multiple pathways, which provides Xiaochaihu Decoction with a better effect. Keywords:Xiaochaihu Decoction; Liver Cancer; Network Pharmacology Methods; Molecular Docking 1 研究背景 肝癌是中国第四位高发的恶性肿瘤,其死亡率已位居第二,仅次于肺癌[1]。肝癌的发展与多种危险因素密切相关。乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒是两种常见的病毒,一旦感染,这些病毒可在肝脏内复制和繁殖,引起慢性肝炎的持续存在。长期的肝炎病程会导致肝组织发生炎症反应,并逐渐形成纤维化(肝纤维化),最终进展为肝硬化, 患有肝硬化的人,尤其是那些长期患有乙型或丙型肝炎的患者,面临着较高的肝癌风险[2-4]。肝癌的早期诊断对于治疗和预后至关重要。然而,早期肝癌通常没有明显的症状,导致难以及时发现。目前,常用的肝癌筛查方法包括肝脏超声检查、血清肝癌标志物检测等[5,6]。治疗肝癌的方法包括手术切除、肝移植、放疗、化疗和靶向治疗等[7]。然而,由于肝癌的异质性和复杂性,治疗仍然面临一系列的挑战,包括药物耐药性、复发和转移等问题[8]。多学科的综合治疗团队在肝癌患者的管理中起着重要作用,中医药可以通过调节机体的免疫功能,提高患者的免疫力,增强对肿瘤的抵抗力。一些中药具有免疫调节和抗肿瘤活性,可能对肝癌的治疗有一定的辅助效果[9]。 小柴胡汤是一种经典的中医方剂,最早出现在《伤寒杂病论》这本古代医学经典著作中。它是由柴胡、黄芩、半夏、生姜、大枣等药物组成的复方药物。小柴胡汤主要用于治疗由肝气郁结引起的病证,如肝郁气滞、胸胁胀痛、胁肋痛、口苦、口干等症状。它被广泛应用于中医临床实践,特别是在治疗一些气机逆行、肝气郁结相关的病症时[10]。小柴胡汤具有多种药理作用和临床应用价值,网络药理学和分子对接作为一种解析药物成分和治疗对象间关联规律的研究手段,可以为小柴胡汤更深层次的药效研究和临床应用提供新的思路和方法,故本文的研究是基于网络药理学和分子对接,从整体性角度出发,强调从系统层次和生物网络解析其作用机制,为小柴胡汤治疗肝癌的研究提供参考依据。 2 研究方法 2.1 小柴胡汤化合物收集 利用TCMSP数据库[11],以柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、甘草、大枣为关键词检索小柴胡汤各药物成分中的化合物。 2.2 小柴胡汤活性化合物及靶标蛋白筛选 为了筛选结果的可靠性,在筛选活性化合物前需要设定筛选的阈值,为此设置了口服生物利用度 (oral bioavailability, OB)≥30%和类药性(drug likeness, DL)≥0.18为筛选阈值[12]。基于此筛选出小柴胡汤各成分中的活性化合物并得出相关靶标蛋白。 2.3 靶标蛋白基因检索 利用UniProt[13]、SwissTargetPrediction[14]等数据库查询所有得到的靶标蛋白对应的official gene symbol,查询所有活性化合物的靶标蛋白基因。 2.4 肝癌靶点检索 以“liver cancer”为检索词,利 用 Gene Cards[15]和DisGeNET[16]数据库建立疾病靶点,共检索到肝癌靶点2719个,进行去重处理后得到2353个靶点。 2.5 小柴胡汤致瘤肝癌交集靶点获取 利用Venny2.1[17]平台对小柴胡汤活性化合物靶标蛋白基因与肝癌靶点进行取交集,得到交集靶点。 2.6 活性化合物-作用靶点-药物成分网络构建 利用Cytoscape 3.10.0 [18]软件构建小柴胡汤活性化合物-作用靶点-药物三元结构网络图,分析化合物和靶点网络,并应用Network Analyzer进行拓扑分析。 2.7 PPI 网络构建及分析 使用String[19]蛋白质相互作用数据库进行分析。将收集到的小柴胡汤活性化合物靶标蛋白基因和肝癌靶点蛋白基因上传到String数据库,选择相应参数进行分析,得到蛋白质相互作用网络图。 2.8 基因功能与 KEGG 通路富集分析 运用DAVID[20]数据库进行富集分析。输入交集靶点基因的名称,并在数据库中进行了检索和转化操作,以获得与这些基因相关的通路富集信息。为了更好地展示结果,使用在线绘图网站Bioinformatics[21]将这些结果进行可视化。 2.9 分子对接 通过网络拓扑学分析,在化合物-靶点相互作用网络中,选择了最高Degree值的3个活性化合物作为配体,以及Degree值排名前3的核心靶点作为受体。通过AutoDockTools 1.5.6软件对配体和受体进行分子对接,并使用PyMOL 2.6.0软件对得到的对接模型进行三维可视化分析。 3. 研究结果 3.1 小柴胡汤化合物筛选 在TCMSP平台上,根据筛选阈值OB≥30%和DL≥0.18,我们检索到了小柴胡汤各组分的活性化合物,总计共有207个。小柴胡汤部分活性化合物信息见表 1。 表1 小柴胡汤中部分活性化合物的基本信息
3.2 小柴胡汤活性化合物靶点与疾病靶点的Venn分析 通过对数据库的筛选和去重,得到了2353个与肝癌相关的靶点和820个与小柴胡汤相关的靶点。将两者取交集后,我们得到了239个交集靶点,如图1所示。 图1 药物靶点与疾病靶点的Venn图 3.3 化合物-靶点相互作用网络分析 小柴胡汤活性化合物与肝癌靶点的化合物-靶点相互作用网络如图2所示。为了进一步探索其中的重要性和联系性,使用Cytoscape软件的Network Analyzer功能对网络进行了拓扑参数计算。通过拓扑参数计算,我们可以确定网络中的关键节点和子网络。例如,节点的连接度(degree)值可以表示节点在网络中的连接程度,连接度较高的节点通常具有更重要的功能。因此,我们可以根据连接度值设置节点的大小,以突出网络中的重要节点。此外,还可以通过计算网络的聚集系数、介数中心性等参数来评估节点的重要性和网络的整体结构。在小柴胡汤与肝癌靶点的化合物-靶点相互作用网络中,平均每个化合物与8.65个靶点相互作用,每个靶点平均与4.59个化合物相互作用。这表明小柴胡汤中存在着多个化合物同时作用于多个靶点的现象,同时不同的化合物也可以共同作用于同一个靶点。这突显了中药多成分与多靶点相互作用的整体性和联系性特征[22]。通过筛选得出前10名的活性化合物分别为山奈酚(Kaempferol)、黄芩苷(Baicalin)、荜澄茄素(Cubebin)、Rivularin、Diop、Sainfuran、Panicolin、Salvigenin、Carthamidin、Moslosooflavone。 图2 小柴胡汤中化合物-靶点网络 3.4 蛋白质互作网络分析 将交集靶点导入String数据库,根据获取的蛋白质相互作用数据,可以构建PPI网络[23]。通过网络调控分析,可以鉴定在小柴胡汤与肝癌蛋白质互作网络中具有关键调控作用的节点。这些节点可能是关键的调控因子或信号传递分子,对整个网络的稳定性和功能起着重要作用。了解这些调控节点的功能和相互关系,可以帮助我们揭示小柴胡汤对肝癌的治疗机制。节点的颜色和大小用于表示其Degree值,节点越大且颜色越深,对应的Degree值就越大。在这个PPI网络中,排名前10位的核心靶标依次是苏氨酸激酶1(AKT1)、HSP90AA1、信号转导和转录激活因子3(STAT3)、非受体酪氨酸激酶(SRC)、表皮生长因子受体(EGFR)、缺氧诱导因子1-α(HIF1A)、组蛋白乙酰转移酶p300(EP300)、雌激素受体α(ESR1)、BCL2和肿瘤坏死因子(TNF)。这些蛋白在小柴胡汤治疗肝癌中扮演了关键的角色,表明它们对于治疗肝癌的有效性具有重要的影响。PPI网络图见图三。这些分析结果为我们深入理解小柴胡汤在治疗肝癌中的作用机制和潜在疗效提供了有价值的信息。进一步的研究可以通过实验验证这些关键蛋白的作用,并探索小柴胡汤与这些蛋白之间的相互作用机制,以进一步加深对小柴胡汤治疗肝癌的认识。 图3 小柴胡汤靶点PPI网络 3.5 小柴胡汤治疗肝癌 GO 富集分析及 KEGG 富集分析 通过DAVID数据库进行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,并获得了一些结果,如图4所示。GO功能富集分析:生物过程(BP)分析获得了875个条目,其中前五个条目是正向调节RNA聚合酶II启动子转录、蛋白质磷酸化、负调控RNA聚合酶II启动子转录、信号转导和正向调节细胞增殖。这些结果表明,在肝癌发展中,交集靶点基因可能参与了这些生物过程,并且在肝癌细胞的增殖、信号传导和转录调控中起重要作用。细胞组分(CC)分析获得了102个条目,其中前五个条目是细胞质、细胞核、细胞膜、核质和质膜。这些结果指示了交集靶点基因在肝癌细胞的不同细胞组分中的定位和活动。分子功能(MF)分析获得了213个条目,其中前五个条目是相同蛋白质结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、ATP结合、蛋白质结合和金属离子结合。这些结果揭示了交集靶点基因在肝癌中可能具有的不同分子功能,如图5(a)~(c)所示。KEGG信号通路富集分析获得了173条信号通路,其中选择了最显著的20个过程进行分析。这些关键信号通路涉及了MicroRNA、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、人乳头瘤病毒感染以及蛋白多糖在癌症中的作用等,如图5(d)所示。通过这些富集分析结果,可以进一步了解交集靶点基因在肝癌发展中的潜在作用、相关机制以及参与的生物学过程和信号通路。这些信息对于深入理解肝癌的发病机制和开发治疗策略可能具有重要意义。 图4 GO 富集分析及 KEGG 富集分析条目数 图5 GO 富集分析及KEGG 富集分析 3.6 核心化合物与关键靶点分子对接 根据对化合物-靶点相互作用网络的网络拓扑分析可以得到小柴胡汤中Degree值前三的活性化合物分别为山奈酚(Kaempferol)、荜澄茄素(Cubebin)、黄芩苷(Baicalin),确定为分子对接配体;根据对交集靶点的蛋白质互作网络(PPI)分析可以得到Degree值前三的靶点分别为STAT3 (PDB ID:6MO9)、AKT1 (PDB ID:1UNQ)、HSP90AA1 (PDB ID:4U93),确定为受体; 应用AutoDockTools 1.5.6 软件进行分子对接和分析,配体和受体对接结合能越低表示分子间结合越稳固,本部分将展示九种对接情况,见表2,以及将对接最佳的前三种进行可视化处理,见图6。 表2 小柴胡汤化合物与肝癌靶点分子对接
图6 分子对接作用关系 4 讨论 近年来,肝癌的发病率和恶性程度在我国持续上升,对国民健康构成了严重威胁。肝癌是一种严重的恶性肿瘤,对患者的生活质量和生存率产生了显著影响[24]。传统中医药在肝癌治疗中的应用已经吸引了广泛的关注和研究,因为中医药具有独特的治疗理念和综合调控的特点。在中医理论中,肝癌被归类为肝胆湿热、瘀血阻络等病机类型,治疗的关键在于调理肝脏功能、清热解毒、活血化瘀。中药方剂常常采用多种草药组合,以达到综合调控的效果;此外,中药还能提高患者的整体免疫力,减轻治疗过程中的不良反应,改善患者的生活质量。例如,某些中药可以减轻化疗和放疗引起的恶心、呕吐和乏力等不适症状[25]。研究人员也进行了中西医结合的临床研究,探索中医药与西医治疗的协同作用。这些研究表明,在中西医结合治疗下,肝癌患者的生存期和生活质量得到了显著改善。中医药的综合调理作用可以提高患者的免疫力,增强药物的耐受性,减少并发症的发生,提高治疗效果。 本研究从小柴胡汤中筛选出207个活性化合物,对应肝癌239个靶点,其治疗肝癌的主要核心成分为山奈酚、黄芩苷、荜澄茄素、Rivularin、Diop、Sainfuran、Carthamidin、Panicolin、Moslosooflavone、Salvigenin等。柴胡中含有山奈酚、荜澄茄素以及黄芩苷等,黄芩中含有Diop、Rivularin及Salvigenin等,人参中含有山柰酚、儿茶素及Diop,半夏中含有黄芩苷;小柴胡汤在治疗肝癌方面的核心靶点包括MMP2、AKR1B1、ESR2、EGFR、CYP19A1、PIM1和PIK3CG等。通过交集靶点蛋白互作网络分析,确定了小柴胡汤治疗肝癌的核心靶标,包括AKT1、SRC、STAT3、EGFR、HIF1A、EP300和HSP90AA1等。通过对小柴胡汤核心化合物与肝癌关键靶点分子的对接研究,发现荜澄茄素与关键靶点的结合能较好。具体而言,荜澄茄素与关键靶点的结合能均 ≤ -5 kcal/mol,表明荜澄茄素与这些靶点具有较强的结合能力。在对接结果中,研究发现受体中的AKT1靶点与荜澄茄素的结合能最低,这表明AKT1是荜澄茄素发挥作用的重要靶点。AKT1是一个重要的信号传导分子,参与多种细胞生存、增殖和凋亡等过程,与癌症的发生和发展密切相关。荜澄茄素与AKT1的结合能力强,可能意味着它在调控肝癌细胞的生存和增殖中发挥重要作用。这些研究发现提供了荜澄茄素作为小柴胡汤核心化合物的潜在作用机制和靶点,为进一步研究和开发小柴胡汤的药物治疗提供了理论依据。然而,需要更多的研究来验证这些发现,并深入了解荜澄茄素与AKT1及其他关键靶点的相互作用机制,以及其在肝癌治疗中的临床应用潜力。 本研究采用网络药理学和分子对接方法,以小柴胡汤为对象,从系统层面和生物网络的整体视角出发,对其治疗肝癌的关键活性化合物、作用靶点以及相关的生物过程和通路进行了分析。研究结果显示,小柴胡汤中的活性化合物通过调节关键靶点,影响机体的免疫反应和应激反应,从而发挥治疗肝癌的作用。这是多种成分、多个靶点和多条途径相互作用的综合结果,为小柴胡汤在临床应用中提供了一定的理论依据。 参考文献 [1]ZHOU M, WANG H, ZENG X, et al. Mortality, morbidity, and risk factors in China and its provinces, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. The Lancet, 2019, 394(10204): 1145-1158. [2]CHEN W, ZHENG R, BAADE P D, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2016, 66(2): 115-132. [3]金保, 杜顺达, 毛一雷, 等.《原发性肝癌诊疗指南 (2022年版)》更新要点解读[J]. 协和医学杂志, 2022, 13(5): 789-795. [4]BRAY F, FERLAY J. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2018, 68(6): 394-424. [5]樊嘉, 王征. 原发性肝癌综合治疗新进展[J]. 国际消化病杂志, 2013 (2): 73-74. [6]吴孟超, 汤钊猷, 刘允怡, 等. 原发性肝癌诊疗规范 (2019 年版)[J]. 中国实用外科杂志, 2020, 40(2): 121-138. [7]李轲宇, 刘连新, 尹大龙. 肝细胞癌外科治疗方式的研究进展[J]. 中华外科杂志, 2016 (2): 148-152. [8]奉建祁, 王志明. 中晚期原发性肝癌治疗的新进展[J]. 中国普通外科杂志, 2021, 30(7): 847-857. [9]赵广生, 徐克, 梁松年, 等. 原发性肝癌 TACE 术后严重并发症原因及预防[J]. 介入放射学杂志, 2008, 17(11): 773-775. [10]代海洋,黄古叶,李媛等.小柴胡汤在肝脏疾病中的应用[J].河南中医,2022,42(06):837-841. [11]Ru J, Li P, Wang J, et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. Journal of cheminformatics, 2014, 6: 1-6. [12]朱梓铭, 张因彪, 郑景辉, 等. 基于网络药理学探究苓桂术甘汤治疗慢性心力衰竭的作用机制[J]. 临床心血管病杂志, 2019 (2): 154-161. [13]UniProt Consortium. UniProt: a hub for protein information[J]. Nucleic acids research, 2015, 43(D1): D204-D212. [14]Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules[J]. Nucleic acids research, 2019, 47(W1): W357-W364. [15]Stelzer G, Rosen N, Plaschkes I, et al. The GeneCards suite: from gene data mining to disease genome sequence analyses[J]. Current protocols in bioinformatics, 2016, 54(1): 1.30. 1-1.30. 33. [16]Piñero J, Bravo À, Queralt-Rosinach N, et al. DisGeNET: a comprehensive platform integrating information on human disease-associated genes and variants[J]. Nucleic acids research, 2016: gkw943. [17]Oliveros J C. VENNY. An interactive tool for comparing lists with Venn Diagrams[J]. http://bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index. html, 2007. [18]Shannon P, Markiel A, Ozier O, et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks[J]. Genome research, 2003, 13(11): 2498-2504. [19]Szklarczyk D, Gable A L, Nastou K C, et al. The STRING database in 2021: customizable protein–protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets[J]. Nucleic acids research, 2021, 49(D1): D605-D612. [20]Dennis G, Sherman B T, Hosack D A, et al. DAVID: database for annotation, visualization, and integrated discovery[J]. Genome biology, 2003, 4(9): 1-11. [21]Zou L A, Jian Q. Identification of hub genes and pathways in psoriasis through bioinformatics and validation by RT-qPCR[J]. 2021. [22]叶坤, 雷敏, 谢欣, 等. 基于网络药理学与分子对接技术探讨黄芪建中汤治疗腹泻型肠易激综合征的作用机制研究[J]. 中国全科医学, 2022, 25(15): 1814. [23]Liu G, Wong L, Chua H N. Complex discovery from weighted PPI networks[J]. Bioinformatics, 2009, 25(15): 1891-1897. [24]左朝晖. 原发性肝癌治疗方法的选择[J]. 中国普通外科杂志, 2002, 11(9): 557-559. [25]李荣.加味小柴胡汤在手术切除与微波消融治疗多发性不同肝段米兰标准肝癌的临床效果[J].黑龙江中医药,2022,51(06):4-6. |