桔梗皂苷的提取及其抗氧化活性的研究

摘要：目的：微波辅助条件下，确定桔梗皂苷的最佳提取工艺，同时探究提取的桔梗皂苷抗氧化活性。方法：首先进行微波辅助提取法的单因素试验，根据结果分别选择乙醇浓度、微波提取功率、微波提取时间及固液比4个因素，每个因素确定提取率最高的3个水平，通过正交试验提取桔梗中的桔梗皂苷，然后通过还原力、氮自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟自由基清除能力试验探究其抗氧化活性。结果：微波辅助下，桔梗皂苷的最佳提取工艺条件为乙醇浓度80%、微波提取功率450W、提取时间200s及液固比15:1，在此条件下，桔梗皂苷提取率可达5.86%。抗氧化试验证明桔梗皂苷具有较好的抗氧化活性。结论：微波辅助提取法具有提取率高、省时等优点，同时证明提取出的桔梗皂苷具有良好的抗氧化活性，为桔梗的进一步深度开发提供更好的参考依据。

关键词：桔梗；桔梗皂苷；正交试验；微波提取法；抗氧化活性

中图分类号：R285.5

Study on the extraction and antioxidant activity of platycodon grandiflorum saponins

GU Kai ,ZHANG Fei, LUO Hongyu, ZHANG Congying 

Department of School of Basic Medicine, Chifeng University, Chifeng 024000

Abstract: Objective To determine the optimal conditions for microwave-assisted extraction of Platycodon grandiflorus saponins and to study the antioxidant activity of the extracted Platycodon grandiflorus saponins. Method Firstly, based on the single factor experiment of microwave-assisted extraction, four factors and three levels of orthogonal experiments were selected to extract platycodon from Platycodon grandiflorus. Then, its antioxidant activity was studied by reducing power, DPPH scavenging ability, superoxide anion scavenging rate, ABTS+radical scavenging rate, and hydroxyl radical scavenging ability. Result The optimal conditions for microwave-assisted extraction of platycodon grandiflorus saponins were ethanol concentration of 80%, microwave power of 450W, time of 200s, and solid-liquid ratio of 1:15. Under these conditions, the extraction rate of platycodon grandiflorus saponins was 5.86%. It has been demonstrated that it has good antioxidant activity through determination of reducing power, DPPH clearance rate, superoxide anion clearance rate, ABTS+radical clearance rate, and hydroxyl radical clearance rate. Conclusion The microwave-assisted extraction method has the advantages of high extraction rate and time-saving. At the same time, it has been proven that the extracted Platycodon grandiflorus saponins have good antioxidant activity, providing a better reference for the further deep development of Platycodon grandiflorus.

Key words:Platycodon; Platycodon platycoside; Orthogonal test; Antioxidant activity

桔梗（Platycodon grandiflorum）是桔梗科植物桔梗的干燥根，为药食同源品种[1]。桔梗中主要含有皂苷类、多糖类、黄酮类等成分。桔梗皂苷具有抗氧化、祛咳止痰、抗炎、镇热解痛等广泛的药理作用[2,3]。抗氧化作用体现为延缓衰老、眼睛和视力保护、减少衰老对皮肤的影响以及预防慢性炎症疾病等方面。

桔梗皂苷可将铁氰化钾的三价铁还原为二价铁，在通过紫外反应其还原能力的大小，吸光度越大，抗氧化能力越大[4-5]。

DPPH是一种常见的测定抗氧化活性的化合物，当与桔梗皂苷反应时，紫色逐渐消失，再通过紫外测定并通过清除率计算公式判断其被还原程度[6-7]。

超氧阴离子清除率是通过弱碱条件下邻苯三酚自氧化反应产生中间产物，桔梗皂苷可有效阻止中间产物的积累从而使其紫外吸光度减弱来评判桔梗皂苷的抗氧化活性[8-9]。

ABTS与过硫酸钾反应可生成在734nm下有最大吸收绿色的ABTS自由基，当加入桔梗皂苷后使其吸光度降低，则可证明桔梗皂苷对其有清除力，从而证明桔梗皂苷具有一定的抗氧化活性[10-11]。

羟自由基清除能力是利用Fenton原理，双氧水与二价铁离子混合后产生羟自由基，在反应体系中水杨酸可以有效捕捉到羟自由基，同时产生有色物质，当加入具有桔梗皂苷样品时，就会与水杨酸竞争羟自由基使有色物质减少从而来判定桔梗皂苷样品对其具有清除能力，从而可证明桔梗皂苷具有抗氧化活性[12-13]。

本文采用微波辅助提取法[14-15]以赤峰地区出产的桔梗为原材料，采用单因素实验及正交试验对桔梗皂苷的微波辅助提取法进行探索。采用还原力、氮自由基（DPPH）清除率、超氧阴离子自由基（O2-）清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟自由基（OH）清除率试验探究桔梗皂苷的总抗氧化能力研究其抗氧化活性[16]，为赤峰地区桔梗的进一步深度开发提供更好的参考数据，为桔梗产品进一步开发及应用展现新的价值。

1实验材料

1.1实验试剂

中药桔梗（赤峰）、桔梗皂苷对照品（98%）、三氯乙酸（分析纯）、乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯）、铁氰化钾（分析纯）、正丁醇（分析纯）、三氯化铁（分析纯）、邻苯三酚（99.5%）、维生素C（99.98%）、Tris-HCL缓冲液（PH=8.0）、DPPH(98.5%）、水杨酸（99.5%）、过硫酸钾（分析纯）ABTS（98%）。

1.2实验仪器

高速多功能粉碎机（SL-250）、分析电子天平（FA2104N）、数显恒温水浴锅（HH-1）、紫外可见分光光度计（756PC）、真空干烘箱（DZ-2BC11）移液枪（YE17BAG0062622，北京大龙兴创实验仪器有限公司）、实验室微波合成仪（XH-MC-1，祥鹄科技）、旋转蒸发器（RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂）、循环水式真空泵（SHB-ⅢB，上海普渡生化科技有限公司）。

2实验方法

2.1桔梗皂苷标准曲线的绘制

2.1.1标准溶液的制备

桔梗皂苷对照品20mg精密称定后用70%甲醇溶液制成[17]浓度为2.0mg/ml的桔梗皂苷标准溶液。

2.1.2标准曲线的绘制

分别准确移取2.0mg/ml桔梗皂苷标准溶液0ul，20ul，40ul，60ul，80ul，100ul于10ml容量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度，以70%甲醇溶液为参比，选取472nm为检测波长，对桔梗中桔梗皂苷含量进行测定，绘制标准曲线。

2.2微波辅助提取法提取桔梗皂苷

取桔梗药材洗净，切片，晾干，粉碎过60目筛。

精密称取桔梗粉末1g，加入60%乙醇溶液，于450W微波炉中萃取200s，冷却至室温，抽滤，浓缩后加饱和正丁醇溶液萃取分离，取上层正丁醇相，重复3次，并合并正丁醇相，真空浓缩后在干燥（60 ℃～65 ℃）至恒重，得桔梗皂苷[18]。根据公式1计算提取率：

                 （1）

2.2.1对乙醇浓度的研究

固定微波功 400W，微波时间 250s，液固比 15:1（ml:g），在乙醇浓度 50%、60%、70%、80%、90% 的条件下萃取[19]，抽滤，按照2.2项下方法计算提取率。

2.2.2对微波功率的研究

固定乙醇浓度 80%，微波时间 250s，固液比 1:15（g:ml），在微波功率 250W、300W、350W、400W、450W的条件下萃取，抽滤，按照2.2项下方法计算提取率。

2.2.3对微波时间的研究

固定乙醇浓度 80%，固液比 1:15（g:ml），微波功率 400W 在微波时间 100s、150s、200s、250s、300s 的条件下萃取，抽滤，按照2.2项下方法计算提取率。

2.2.4对固液比的研究

固定乙醇浓度 80%，微波时间 250s，微率 400W，在固液比 1:10、1:15、1:20、1:25、1:30（g:ml）的条件下萃取，抽滤，按照2.2项下方法计算提取率。

2.2.5正交试验优化

精密称取桔梗粉末9份，每份1g，在微波辅助提取法单因素试验的基础上，分别选取乙醇浓度 70%、80%、90%，微波功率 350W、400W、450W，时间150s、200s、250s，固液比 1:15、1:20、1:25（g:ml），进行4个因素与3个水平的正交试验。

2.3抗氧化实验

以维C为阳性对照，分别测定提取的桔梗皂苷的还原力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟自由基清除能力。

3实验结果

3.1桔梗皂苷标准曲线的绘制

桔梗皂苷的标准曲线图如图1所示，回归方程为：A=0.0034X+0.0063，R2=0.9975。

图 1桔梗皂苷标准曲线图

3.2 微波辅助提取法提取桔梗皂苷

3.2.1对乙醇的浓度研究

乙醇浓度对桔梗皂苷提取率影响结果如表1所示，为保证实验准确性选取乙醇浓度70%、80%、90%作正交试验。

表1 微波辅助提取法乙醇浓度单因素桔梗皂苷提取率

3.2.2对微波功率的研究

微波功率对桔梗皂苷提取率影响结果如表2所示，为保证实验准确性选取350W、400W、450W作正交试验。

表 2 微波辅助提取法微波功率单因素桔梗皂苷提取率

3.3.3对时间单因素的研究

时间对桔梗皂苷提取率影响结果如表3所示，为保证实验准确性选取微波时间150s、200s、250s作正交试验。

表3 微波辅助提取法时间单因素桔梗皂苷提取率

3.2.4对固液比单因素研究的结果

液固比对桔梗皂苷提取效率影响如表4所示，为保证实验准确性选取液固比15:1、20:1、25:1作正交试验。

表4微波辅助提取法固液比单因素桔梗皂苷提取率

3.2.5正交试验结果

微波辅助提取法正交试验因素和水平如表5所示，根据表6结果可知微波辅助条件下，桔梗皂苷的最佳提取工艺条件为乙醇浓度为80%、微波提取功率为450W、提取时间200s及液固比15:1，在此条件下，桔梗皂苷提取率为5.86%。通过比较极差R可知各因素对微波提取桔梗皂苷提取率影响的次序为微波提取时间>液固比>微波功率>乙醇浓度。

表5 微波辅助提取法正交试验因素和水平表

表 6 微波辅助提取法L9（34）正交试验表

3.3桔梗皂苷的抗氧化性研究结果

桔梗皂苷的抗氧化活性研究结果如表7所示，以维C为阳性对照，微波辅助提取法提取出的桔梗皂苷吸光度为2.069；对DPPH清除率为83.2%；对超氧阴离子清除率为71.24%；ABTS+自由基清除率为81.26%；对羟自由基清除率为80.3%，表明通过微波辅助提取法提取出的桔梗皂苷具有一定的抗氧化活性。

表7 桔梗皂苷的抗氧化性研究结果

4 讨论

本文通过对产地为赤峰地区的桔梗中桔梗皂苷进行提取，确定了微波辅助条件下，桔梗皂苷的最佳提取工艺条件为时间200s、液固比15:1、微波功率450W、乙醇浓度80%，在此条件下，桔梗皂苷提取率为5.86%。在多因素考察中，通过对R值的分析，微波辅助提取法对桔梗皂苷提取率的影响为微波时间>液固比>微波功率>乙醇浓度。通过还原力测定、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力、ABTS+自由基清除能力、羟自由基清除能力五种试验证明提取出的桔梗皂苷具有较好的抗氧化活性。

使用微波辅助提取法提取桔梗皂苷，经过微波的萃取，破坏了植物细胞壁和细胞膜，有利于桔梗皂苷的浸出，提高桔梗皂苷的提取效率，可为桔梗的进一步开发提供更好的参考数据，为其药理活性的研究提供进一步依据，为桔梗产品进一步开发及应用展现新的价值。

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基金项目：内蒙古自然科学基金资助项目（No.2019BS08006）；赤峰市科协项目（No.21）；赤峰学院2022年度教育教学研究项目（JYJXY202203）；赤峰学院2023年度大学生创新创业训练计划项目（S202310138031）