基于ALPPS大鼠模型术后时间序列肝脏转录组对Nsd2在肝脏再生中的初步研究

摘要：目的 通过构建ALLPPS大鼠模型，并对术后四个不同时期的剩余肝脏体积（Future liver remnant，FLR）进行mRNA转录组测序分析，挖掘ALPPS术后影响FLR再生的关键基因，为研究肝脏再生提供理论基础和证据。方法 收集ALPPS术后12h、24h、48h和72h等四个不同时期的Wistar大鼠FLR进行转录组测序，通过STEM趋势分析挖掘不同时期差异表达基因，并对差异基因进行Reactome富集分析，挖掘再生相关通路，通过STRING数据库对富集在cell cycle通路的基因进行PPI网络分析筛选节点基因以及实验验证。结果 对四个时间FLR的转录组数据进行了趋势分析，识别出7个差异表达模块基因集，其中profile 18与肝脏再生速度同步变化，包含481个基因。对这些基因进行Reactome富集分析，得到237条显著通路（P＜0.05）。在cell cycle通路中构建差异基因蛋白质互作网络，并发现Nsd2为关键节点基因，其mRNA表达在术后随时间显著上调，在48小时达到峰值并与FLR再生速率紧密相关。结论 profile 18中包括的481个基因可能在调控ALPPS术后FLR再生中具有重要作用，Nsd2节点基因可能通过调控细胞周期（Cell cycle）通路，从而促进ALPPS术后FLR的快速再生。

关键词：ALPPS；转录组测序；增殖；Nsd2

中图分类号：R61

Temporal Transcriptomic Analysis of Nsd2 in Liver Regeneration Post-ALPPS Surgery: A Rat Model-Based Preliminary Study

REN Hongbing   ZHU Hai   JIN Zongrui   Zhou Jinyuan   WEN Zhang(Corresponding author)

Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530021

Abstract: Objective To construct an ALPPS (Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged hepatectomy) rat model and perform mRNA transcriptome sequencing analysis on the future liver remnant (FLR) at four different postoperative time points, with the aim of identifying key genes that influence FLR regeneration following ALPPS surgery. This investigation provides a theoretical foundation and empirical evidence for studying liver regeneration. Methods mRNA transcriptome sequencing was performed on the FLR of Wistar rats at four distinct postoperative time points (12h, 24h, 48h, and 72h) following ALPPS surgery. STEM trend analysis was utilized to identify differentially expressed genes across these periods. Reactome pathway enrichment analysis was conducted for these differential genes to uncover regeneration-related pathways. Furthermore, PPI network analysis of genes enriched in the cell cycle pathway was executed using the STRING database to select hub genes for experimental validation. Results Trend analysis on the transcriptomic data from FLR at the four time points revealed seven sets of differentially expressed module genes, with profile 18 showing synchronous changes with liver regeneration rate, encompassing 481 genes. Reactome enrichment analysis of these genes resulted in 237 significantly enriched pathways (P < 0.05). A protein-protein interaction network was constructed within the cell cycle pathway, highlighting Nsd2 as a critical hub gene. The mRNA expression level of Nsd2 was found to significantly increase post-surgery over time, peaking at 48 hours and closely correlating with the FLR regeneration rate. Conclusion The 481 genes within profile 18 are likely to play significant roles in regulating FLR regeneration after ALPPS surgery. The hub gene Nsd2 potentially facilitates rapid regeneration of FLR post-ALPPS through its regulatory effect on the cell cycle pathway.

Keywords: ALPPS;Transcriptome Sequencing;Proliferation;Nsd2

0 引言

目前肝切除手术仍是根治肝癌的治疗方式之一，通过切除肿瘤达到治愈患者的目的[1]，五年生存率能达到25%。联合肝实质分隔和门静脉结扎的二步肝切除手术（Associating Liver Partition and Portal Vein Ligation for Staged Hepatectomy，ALPPS）作为一种针对术后剩余肝脏体积（Future liver remnant，FLR）不足而无法开展根治性肝切除手术的治疗方式[2]。ALPPS-I期手术能够在短时间内快速诱导FLR再生。当FLR足够时，实施ALPPS-II期手术切除肿瘤侧肝脏。因此，研究ALPPS术后促进肝脏再生的分子机制对提高手术成功率和手术适应症范围至关重要。

近年来，转录组测序技术（RNA-Seq）被广泛运用于肿瘤疾病研究中，该项技术能够高效且全面地揭示特定细胞或组织在特定生理或病理条件下的几乎全部转录产物（包括编码蛋白质的mRNA和非编码RNA）的序列信息及其表达状况。本研究，对ALPPS术后12h、24h、48h和72h共4个不同时期的Wistar大鼠模型的肝脏组织进行转录组测序并比较分析，并对在ALPPS术后不同时期肝脏组织中差异表达的基因集进行Reactome富集分析，筛选出有意义的基因，通过qRT-PCR进一步实验验证，为寻找促进ALPPS术后肝脏再生的基因和调控机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

动物来源斯贝福（北京）生物技术有限公司的24只健康SPF级Wistar雄性大鼠，生产许可证号SCXK（京）2019-0010，在广西医科大学动物实验中心饲养，环境条件为温度23-26℃、湿度44%-55%、光照时段9:00-17:00。该实验方案通过广西医科大学伦理委员会审批（伦理号20230605）。将24只大鼠随机分配至4个手术后时间组：ALPPS 12h组6只、24h组6只、48h组6只及72h组6只。

1.2 方法

1.2.1 动物模型构建

ALPPS组:术前8 h禁食，用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg，腹腔注射)麻醉实验大鼠，麻醉成功后，大鼠备皮、消毒后打开腹腔。逐步分离出肝右叶门静脉支、左外叶及左中叶门静脉支，予以4-0 手术缝线进行结扎，保留右中叶和尾状叶的门静脉血供；最后离断镰状韧带，沿着肝中叶缺血带用组织钳进行分隔肝实质，（图1）。确认腹腔无出血后，用3-0 丝线逐层关闭腹腔，消毒。

注：RLL：右外叶；RML：右中叶；LML：左中叶；LLL：左外叶；CL：尾状叶；#：肝右门静脉支；*：左外叶及左中叶门静脉支。

图1   LPPS模型建立

取肝脏组织及处理：收集大鼠的取材术前体重以及右中叶重量。收取术后12h，24h，48h，72h大鼠的肝右中叶标本。迅速解剖整个肝脏，一部分肝右中叶组织放入10%甲醛溶液进行固定。剩余部分通过液氮转移-80℃超低温冰箱长期保存。

1.2.2 提取总RNA及转录组测序

收集24只老鼠右中叶肝组织，按照送检要求由广州基迪奥生物科技有限公司完成总RNA提取、质检并进行mRNA转录组测序，采用llumina Novaseq6000进

表1   研究使用的引物序列

行转录组表达谱测序。

1.2.3 差异表达基因分析及富集分析

基于基因表达量信息，通过 R （http://www.r-project.org/）开展主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）。趋势分析是一种通过对具有时间、空间或处理梯度连续样本的基因表达数据进行聚类，识别基因表达模式变化的方法。利用STEM软件(http://www.cs.cmu.edu/～jernst/stem)对mRNA转录组数据进行趋势分析，设定参数（log2差异倍数绝对值＞1,P＜0.05），选取20个趋势深入研究，筛选显著及预期相符的趋势。采用Reactome数据库，对筛选出的差异表达基因进行功能注释以及通路显著性富集分析。应用 STRING[3]蛋白质互作数据库( http://string-db.org ) 和 Cytoscape[4]进行差异基因蛋白互作网络的分析，以以FPMK值作为mRNA表达水平，将筛选基因绘制不同时间点肝脏组织的表达量热图。

1.2.4 免疫组化染色

检测中Ki67表达水平，右中叶组织经甲醛固定，历经脱水、石蜡包埋制成3 μm切片。按照标准流程进行烤片预处理、脱蜡、抗原修复、内源性过氧化物酶灭活及封闭。使用1:10稀释的一抗4℃孵育过夜。次日，TBST溶液洗涤四次（每次5分钟），接续二抗孵育，于37℃恒温箱中孵育30分钟。再次TBST冲洗四次后，采用DAB显色，随后进行脱水脱醇步骤，最终封片晾干。

1.2.5 qRT-PCR

对ALPPS各组的肝组织样本进行qRT-PCR验证，Trizol法从右中叶肝组织中提取总RNA,PrimeScriptRT试剂盒逆转录合成cDNA,SYBR Green PCR Master Mis进行PCR,将GAPDH作为内参标准来检测Nsd2的表达变化，用2-ΔΔCt法表示Nsd2相对表达水平，引物序列见表1。

1.3 计学分析

使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。连续变量采用单因素方差分析，Bonferroni检验用于事后比较。所有的实验均进行独立重复操作6次，P＜0.05被认为具有统计显著性。

2 结果

2.1 ALPPS大鼠肝脏右中叶的增生情况

对比大鼠术后不同时间点的肝体重比，结果显示ALPPS术后24h术后肝右中叶出现明显增殖，其中24h-48h增殖速度明显提高（图2A）。与12h、24h和72h相比，48h组FLR的Ki67表达水平最高（图2B），48h组FLR的增殖水平较高。结果证明构建ALPPS动物模型成功。

注：A.大鼠肝体重比显示ALPPS组术后24h后呈现明显的增长趋势。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。B.ALPPS组术后不同时间免疫组化Ki67阳性细胞计数，呈现先高后低的趋势，术后48h阳性细胞数最多，放大倍数：400x。

图2   鼠术后肝组织再生情况

2.2 ALPPS大鼠4个术后不同时期剩余肝脏组织差异表达基因的趋势分析

从图3A中可以看出，PC1和PC2分别代表了67.2%和13.7%的数据方差。不同样本类型在PC1上的分布情况有所不同。结果表明随着术后时间的推移，ALPPS动物模型不同组的基因表达具有差异。

从图3B可得，图表中的每个方格代表一种基因表达趋势模型，表达曲线形状各不相同，反映出基因在不同时间点（ALPPS-12h、ALPPS-24h、ALPPS-48h和ALPPS-72h）下的表达变化趋势。其中包含了7个趋势模型的表达曲线和对应的统计学具有显著性。其中profile 18 趋势模型的基因表达趋势符合ALPPS大鼠模型的肝再生速度情况。从图3C结果表明，有481个基因被分配到这个表达趋势模型（profile 18），其中预期的基因数量为211.7，但实际分配的基因数量远高于预期值，因此可以认为这个表达模式具有显著性（P = 1.6e-58）。该profile 18模块的基因表达水平从12h至48h一直呈现上调趋势，然后在ALPPS-48h开始达到顶峰，最后在ALPPS-72h时开始下降。这些结果表明，该模块的481个基因表达趋势是由于ALPPS手术所导致的，并且在不同时间点表现出特定的表达趋势。

注：ALPPS对Wistar大鼠FLR转录组测序差异表达基因的影响。A.ALPPS术后各组之间的主成分分析；B.通过对ALPPS术后各组差异表达基因的趋势分析得到显著富集的基因表达趋势模型，有颜色表示趋势显著富集，P＜0.05；C.在ALPPS术后12h、24h、48h和72h四组中，profile 18的趋势分析具有统计学意义，P＜0.05。

图3   PPS对Wistar大鼠FLR转录组测序差异表达基因的影响

2.3 profile 18的Reactome富集分析

通过对profile 18中481个基因进行Reactome富集分析，共得到237条P＜0.05的通路，如图4A所示，ALPPS的profile 18表达模块基因显著富集于有丝分裂中期（Mitotic Prometaphase）、细胞周期，有丝分裂（Cell Cycle， Mitotic）、细胞周期（Cell Cycle）以及RHO GTP酶效应蛋白（RHO GTPase Effectors）等。表明细胞周期（Cell Cycle）相关通路的调控可能在ALPPS促进大鼠肝脏再生方面发挥重要作用。

2.4 Cell Cycle通路中差异表达基因的PPI网络分析和筛选关键基因

将富集在Cell Cycle通路中差异表达基因通过STRING数据库[3]和Cytoscape [4]构建蛋白互作关系网络图(图4B)，将上述Cell cycle通路中17个基因在术后不同时期肝右中叶的表达量绘制成热图（图4C），这些结果表明，这17个基因随着时间的推移，表达量先升高后下降，这可能是因为这些基因在调控细胞周期相关通路方面发挥了作用，进而在肝脏中表达促进肝细胞增殖。其中Nsd2和E2f2是该通路的节点基因，Nsd2基因节点较大，代表该基因的丰度值较高，即连通性越强。

2.4 A qRT-PCR验证节点基因Nsd2在术后不同时期肝右中叶组织中的表达水平

qRT-PCR结果（图5）显示，ALPPS组中Nsd2的mRNA表达水平随着手术术后呈现先高后低的趋势，其中在术后第48h达到峰值，在术后72h时，Nsd2的mRNA表达水平出现显著下降。

注：A.Reactome信号通路富集分析结果;B.ALPPS大鼠模型Cell Cycle 通路中差异表达基因的PPI网络分析；C.ALPPS大鼠模型Cell Cycle 通路中差异表达基因的表达热图。

图4   rofile 18的基因富集分析及核心基因筛选

注：*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。

图5   RT-PCR检测Nsd2表达水平

3 讨论

ALPPS手术为解决因剩余肝脏体积不足而无法手术切除的肝癌患者提供了创新治疗机会，改善了无法进行肝部分切除手术患者的治愈率和生存期[5]。研究ALPPS术后肝再生过程中的具体分子机制有助于进一步优化手术方案、降低并发症发生率，还能为开展ALPPS促进肝脏再生的提供理论依据。因此，本研究对比ALPPS术后中不同时间点大鼠肝脏的mRNA转录组数据，探讨了Nsd2基因通过调控细胞周期通路进而促进肝再生。

有研究表明，表观遗传调控因子Nsd2又称WHSC1或MMSET[6]，是核受体结合域NSD家族成员之一[7]，在多种生物学途径中都发挥了重要作用，尤其是在调控细胞周期和影响肿瘤发生发展等方面[8]。同时，Nsd2作为组蛋白甲基转移酶的一员，具有催化组蛋白H3在K36位点进行甲基化的特异性功能，这种修饰可直接调控基因转录活动水平来影响细胞增殖速度与分化状[9]。

在本研究中，我们通过ALPPS大鼠及mRNA转录组测序技术发现了Nsd2基因在肝脏再生过程中的关键作用。有研究[10]发现Nsd2通过催化组蛋白H3K36位点的甲基化，调控着众多细胞周期相关基因的表达，从而影响细胞从G1期进入S期的速度和效率。Xu Han等人研究[11]发现NSD2通过调控 Akt/Erk 信号传导和调节 Bcl-2 和 Bax 表达来促进细胞增殖和延迟细胞凋亡。Nsd2促进细胞增殖和我们研究结果一致，由图4a可得，ALPPS术后不同时间点差异表达的基因集富集通路在细胞周期通路中具有显著意义，由图4b可知，Nsd2作为一个表观遗传调控因子，在细胞周期通路中的蛋白质互作网络分析表现出了节点基因的角色，对肝再生进程的重要作用。

根据mRNA转录组数据和肝脏再生的增殖情况，由图4c和图5可得，我们观察到，在ALPPS术后，Nsd2的mRNA表达趋势呈现显著上调，并在术后48h达到顶峰，并与FLR的再生速度密切相关。

在本研究中，我们运用ALPPS动物模型和mRNA转录组测序技术，系统性地探讨了Nsd2基因在肝脏再生过程中的作用及其潜在机制。Lei Zhu等人[12]通过敲低Nsd2基因发现，NSD2 调节的 TGF-β1/TGF-βRI/SMADs 信号通路激活对能够促进宫颈细胞增殖。在本实验结果发现，在ALPPS手术后，Nsd2表达上可能与肝脏再生速率相关，并且通过PPI互作网络分析也证实了Nsd2在细胞周期通路的重要调节作用。我们的研究首次提供了确凿证据，证明Nsd2是介导ALPPS术后肝脏再生过程的关键调控因子之一，并且其在促进肝再生方面的功能对于优化ALPPS手术策略、降低并发症风险以及开发新的促肝再生疗法具有重要价值。

尽管本研究取得了一定的进展，但关于Nsd2如何精确调控细胞周期的具体分子细节以及其与其他重要转录因子和非编码RNA之间的相互作用尚需进一步探究。

4 结论

综上所述，本研究强调了Nsd2在ALPPS术后肝再生过程中的重要作用，并通过Reactome富集分析和PPI分析初步揭示了其通过调控细胞周期通路促进肝细胞增殖的潜在机制，为未来探索有效的肝再生的治疗靶点提供了新的思路和方向。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金委员会，地区基金（82160128）。