动脉粥样硬化中巨噬细胞活化关键基因的筛选

摘要：目的 基于生物信息学方法分析和探索动脉粥样硬化可能的发病机制，筛选影响巨噬细胞活化的关键基因。方法 使用GEO数据库下载动脉粥样硬化斑块巨噬细胞样本的芯片数据，并进行差异表达基因(DEGs)分析，然后选择显著上调的基因和显著下调的基因用于基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析。然后通过String11. 0在线数据库构建分析蛋白质之间的相互作用(PPI)网络，使用 Cytoscape v3. 6. 1及其插件MCODE分析PPI网络的中心节点蛋白质，筛选出巨噬细胞活化过程中的关键基因。结果 通过对 GSE213189 数据集的分析,共鉴定出200个 DEGs，其中上调140个,下调60个;这些基因主要涉及神经元死亡、氧化应激反应、RNA聚合酶II启动子对内质网应激转录的正调控等生物学进程; KEGG通路分析发现DEGs主要集中在脂质与AS信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、趋化因子信号通路等; 通过蛋白质PPI网络分析后确定Trp53、Jun、Stat3、Fos、Il10、Fn1、Cxcl1、Egr1、Atf3为关键基因。结论 所筛选的关键基因可能成为早期诊断动脉粥样硬化的标志物或潜在治疗靶点,并为该病的发病机制研究提供了新的理论依据。

关键词：动脉粥样硬化；巨噬细胞活化；生物信息学；差异基因；富集分析

中图分类号：R543.5

动脉粥样硬化是起始于动脉血管壁的一种慢性疾病，在全世界范围内，它都是导致死亡和威胁公民寿命的重要疾病之一[1]。研究表明，动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是引发心血管疾病的首要原因[2]。针对该疾病的研究表明，导致了许多关于动脉粥样硬化损伤形成和并发症如心肌梗死和中风的病理生理学的令人信服的假说。AS以血管壁上积聚的粥样脂质斑块为特征。脂质及其他元素的沉积可介导动脉血管的硬化及血管腔的缩小，阻碍血流的通行，导致组织、器官供血不足；当斑块破裂时，还会引发中风、心肌梗死等急性心血管疾病[3-4]。

AS的形成和发展是一个连续的过程，涉及了多个环节。研究表明，动脉粥样硬化的形成起始于动脉内壁内皮细胞的损伤，受到刺激的内皮细胞接着表达黏附因子招募白细胞[5]。同时，含胆固醇的低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）在内皮下间隙积聚[6-7]。白细胞分化的巨噬细胞进一步吞噬低密度脂蛋白成为泡沫细胞，它们在动脉壁的存在是早期AS病变的标志[8]。

巨噬细胞是哺乳动物组织的重要组成部分，在先天免疫系统中起着至关重要的作用[9]。巨噬细胞起源于骨髓中的髓系祖细胞，并发育成循环单核细胞。在某些情况下，它们进入动脉内膜，在那里分化成病变巨噬细胞(Randolph，2014)[10]。LDL-胆固醇水平升高和氧化型LDL在内皮下空间的积聚导致单核细胞和淋巴细胞募集并滞留在动脉壁内。巨噬细胞在血管壁中的积聚是动脉粥样硬化的标志[11-12]。

它在维持炎症反应、促进斑块形成和促进血栓形成中起着重要作用[13]。越来越多的研究表明，巨噬细胞的活化在动脉粥样硬化所有阶段都发挥了作用[14-16]。

关于动脉粥样硬化疾病的发病机制存在许多学说，尽管相关研究已经取得很大的进展，目前仍然缺乏明确的研究指出脂蛋白氧化、炎症和免疫等过程对参与人类动脉粥样硬化疾病的发展发挥的作用。本研究通过生物信息学分析动脉粥样硬化斑块中活化、未活化巨噬细胞的差异基因、相关通路及关键蛋白的 PPI,以确定巨噬细胞活化关键基因、通路和中枢蛋白，可为心血管疾病的临床治疗提供新的思路，即在早期斑块发展时降低活化巨噬细胞含量，抑制斑块形成，从而阻断心血管疾病的发展。

1 对象与方法 

1.1 GEO 芯片数据来源 

以“atherosclerosis macrophage”作为关键词,在美国国立生物中心(NCBI)的GEO数据库搜索已公布的动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的基因芯片数据集。本研究使用GSE213189数据集，该数据集来源于GPL19057平台Illumina NextSeq 500，实验组细胞取自4组动脉粥样硬化早期小鼠主动脉巨噬细胞。对照组使用来自4组无动脉粥样硬化小鼠主动脉巨噬细胞。

1.2 数据处理及筛选差异表达基因 

将 GSE213189数据集中的数据分组后，使用R语言程序包DESeq2对数据进行归一化处理，BiocManager、limma、pheatmap等分析工具进行差异基因分析和制作热图。利用 R 语言limma工具包输出同时满足条件：(|log2FoldChange |>1，padj <0.05)且P < 0. 05的差异表达基因(DEGs)，根据相应平台文件所对应的R语言hgu133a. db程序包被用于将探针名转化为基因名；选择heatmap. 2工具包来绘制热图，将每个DEGs的差异表达情况进行直观展示。

1.3 差异基因富集分析

为了描述DEGs的生物学特征和进行功能注释，使用DAVID(https：／／da— vid．ncifcrf．gov／t001s．jsp)数据库和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库(https：／／www．kegg．jp／)分别进行功能注释和通路富集分析，得到了GSE213189数据集差异基因富集的重要通路。

1.4 P P I蛋白质相互作用网络构建

基因/蛋白质的功能和相互作用的分析可能提供AS中巨噬细胞活化机制的新线索。通过以下网站在检索相互作用基因/蛋白质的搜索工具（STRING）数据库中对DEGs进行蛋白质相互作用分析，以获得PPI网络：https://string-db.org/。利用Cytoscape软件将差异基因相互作用的网络进行可视化，将关联程度最高的基因指定为核心基因。利用插件Molecular Complex 

Detection（MCODE）进行模块分析，筛选条件：degree cut-off=2, max. depth=100，k-core=2, haircut on, node score cut-off=0.2, P＜0.05。

2 结果

2.1 差异基因

将GSE213189数据集中无AS小鼠主动脉巨噬细胞与AS早期小鼠主动脉巨噬细胞序列对比，得到差异基因200个，其中，上调基因140个，下调基因60个。根据AS早期巨噬细胞和无AS巨噬细胞比较的差异基因绘制火山图及热图，AS早期巨噬细胞与正常巨噬细胞间聚类明显，见图1。

A.火山图 横坐标是logFoldChange，纵坐标是-log10(padj)。

B.热图 横坐标代表样品，纵坐标代表基因。

图1   火山图及热图

2.2 GO及KEGG分析 

200个差异表达基因的GO分析主要富集于神经元死亡、对氧化应激的反应、RNA聚合酶II启动子对内质网应激转录的正调控、细胞对氧化应激的反应等（见表1、图2、图3）；KEGG信号通路主要富集于脂质与AS、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、趋化因子信号通路等（见表2）。

图2   GO富集柱状图 

纵坐标是富集的GO，横坐标是富集在每个GO上基因的数目。

图3   GO富集气泡图

纵轴是富集的GO，横轴是富集在该GO上的基因数目比率。

2.3 PPI 网络构建与枢纽基因分析

使用STRING在线工具，将200个AS早期巨噬细胞与正常巨噬细胞差异表达基因绘制PPI拓扑网络，在评分 > 0.7 的置信度下得到网络中有67个蛋白节点，144个作用关系。由柱状图可以看出，排名前10的基因有Trp53、Jun、Stat3、Fos、Il10、Fn1、Cxcl1、Egr1、Atf3，其中，Trp53、Jun、Stat3等基因与其他基因相互作用关系最多，位于互作网络的最核心（见图4）。

图4   A.蛋白相互作用网络图 B.互作网络邻接节点数目

3 讨论

在本研究中，我们选择GSE213189数据集用于鉴定动脉粥样硬化中巨噬细胞活化的DEGs，运行R语言limma工具包时满足(|log2FoldChange |>1，padj <0.05)且P < 0. 05条件的视为差异基因。最终共获得到140个DEGs，其中包括140个上调基因和60个下调基因。GO功能注释和KEGG富集分析结果表明，DEGs主要富集于氧化应激反应、脂质相关、趋化因子信号通路。这些都与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。在这些差异基因中，Trp53、Jun、Stat3等基因位于互作网络的最核心。

Trp53是迄今发现的与人类肿瘤相关性最高的肿瘤抑制基因，一直是肿瘤学领域研究的热点，但鲜少有研究关注其与动脉粥样硬化疾病的关系。根据Matesanz等人的报道，造血细胞的TP53突变可通过调节巨噬细胞增殖和凋亡来加速动脉粥样硬化的发展并增加斑块中的巨噬细胞[17]。此外，已有文献报道，JUN基因是编码激活蛋白-1 (AP-1)复合转录因子的原癌基因。这些蛋白质一起构成的蛋白复合物AP-1，是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK/激酶)信号通路的主要成分。该途径通过激活细胞过程，如增殖、分化和凋亡，参与疾病的发展[18]。

信号转导和转录激活因子3 (STAT3)参与炎症和细胞转化，已被证明与巨噬细胞的极化有关。）巨噬细胞极化可导致各种表型，并且是与AS斑块形成有关的关键过程[19]。

目前，已有少量报道证实以上基因与AS中巨噬细胞的活化有着密切关系，由于条件的限制，本文研究结果尚存局限性，笔者认为后续可进一步通过生物学实验验证的可在后续研究中予以探索和开展，以期进一步揭示AS的病理生理机制并为研发靶向药物提供一定科学理论依据。

总之，我们的生物信息学分析确定了与AS中巨噬细胞的活化显著相关的基因。这些基因和途径可以作为新的潜在靶标，用于开发动脉粥样硬化患者的治疗方法。

参考文献

[1] Benjamin E J, Blaha M J, Chiuve S E, et al. Heart disease and stroke statistics—2017 update: A report from the american heart association[J]. Circulation,2017,135(10):146-603.

[2] Hansson G K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease[J]. The New England Journal of Medicine,2005,352(16):1685-1695.

[3] Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s[J]. Nature,1993,362(6423):801-809.

[4]刘俊田.动脉粥样硬化发病的炎症机制的研究进展[J].西安交通大学学报:医学版,2015,36(2):12.

[5]赵雨轩,徐赟晟,倪晶宇,等.血管细胞黏附分子-1与动脉粥样硬化机制的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2018,34(12):3.

[6] Kuk M, Ward N C, Dwivedi G. Extrinsic and intrinsic responses in the development and progression of atherosclerosis[J]. Heart, Lung and Circulation,2021(8):32.

[7] Franceschi C, Campisi J. Chronic inflammation (inflammaging) and its potential contribution to age-associated diseases[J]. Journals of Gerontology,2014,69(Suppl 1):S4-S9.

[8] Saltiel A R, Olefsky J M. Inflammatory mechanisms linking obesity and metabolic disease[J]. Journal of Clinical Investigation,2017,127(1): 1-4.

[9] Mian M O R, Paradis P, Schiffrin E L. Innate immunity in hypertension[J]. Current Hypertension Reports,2014,16(2):413.

[10] Ross S, Gerstein H, Paré G. The genetic link between diabetes and atherosclerosis[J]. Canadian Journal of Cardiology,2018,34(5): 565-574.

[11]赵曼曼,程丝,李嫣然,李昊,王拥军.单细胞测序技术解析动脉粥样硬化巨噬细胞异质性的研进展[J].中国卒中杂志,2023,18(2):180-184.

[12] Restini C B A, Fink G D, Watts S W. Vascular reactivity stimulated by TMA and TMAO: Are perivascular adipose tissue and endothelium involved?[J]. Pharmacological Research,2021,163(44): 105273.

[13] Xu H B, Wang T, Liu S C, et al. Extreme levels of air pollution associated with changes in biomarkers of atherosclerotic plaque vulnerability and thrombogenicity in healthy adults[J]. Circulation Research,2019,124(5): e30-e43.

[14]潘桔红,陈粤瑛,胡玉刚,周青.巨噬细胞极化在动脉粥样硬化中研究演变的可视化分析[J].中国医学科学院学报,2023,45(4):608-617.

[15] Bijl M. Endothelial activation, endothelial dysfunction and premature atherosclerosis in systemic autoimmune diseases[J]. The Netherlands Journal of Medicine,2003,61(9):273-277.

[16]张皓南,任博文,纪元浩,谷佳鑫,郑子琦,刘文秀.巨噬细胞程序性死亡在动脉粥样硬化中的研究进展[J].中国现代医学杂志,2023,33(8):43-49.

[17] Pietro N D, Formoso G, Pandolfi A. Physiology and pathophysiology of oxLDL uptake by vascular wall cells in atherosclerosis[J]. Vascular Pharmacology,2016(84):1-7.

[18] da Silva Queiroz JP, Pupin B, Bhattacharjee TT, et al. Expression data of FOS and JUN genes and FTIR spectra provide diagnosis of thyroid carcinoma. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc,2024,5(304):123305.

[19] Wang G , Liu X , Li X ,et al.Suppression of PAPP-A mitigates atherosclerosis by mediating macrophage polarization via STAT3 signaling[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications,2021(543):29-37.

基金项目：重庆市铜梁区科学技术局2022年区级科技计划项目，编号：2022014。